[发明专利]一种羟酸酯的手性拆分方法

说明书

本发明涉及一种采用α‑羟酸氧化酶拆分外消旋α‑羟酸酯的方法，属于生物工程领域。可应用于光学纯α‑羟酸酯的制备。

技术领域

本发明公开了一种采用氧化酶拆分α-羟酸酯的方法，属于工业微生物领域。

背景技术

α-羟酸酯(alpha-hydroxy esters)是α-羟酸与醇酯化脱水后得到产物，在医药领域有着广泛的应用，如丹参素与异丙醇脂化后生成的丹参素异丙酯等。

化学合成的外消旋α-羟酸酯常用的酶拆分的方法是采用脂肪酶或酯酶水解方案，如一种酯酶拆分(±)-扁桃酸甲酯的方法(中国专利201510212293.4)、猪胰脂肪酶作水解拆分甘油丁酸酯(缩水甘油丁酸酯的对映选择性酶促水解.华南理工大学学报，1999，25(2)：209～212)、Novozym 435对羟基苯甘氨酸甲酯的不对称水解(脂肪酶催化外消旋对羟基苯甘氨酸甲酯水解制备对映体纯D-对羟基苯甘氨酸的新方法.催化学报，2005，26(2)：106～110)等。但脂肪酶的立体选择性不高，很难在高回收率下得到99％以上的光学纯产品。

本发明采用α-羟酸氧化酶进行α-羟酸酯的手性拆分，α-羟酸氧化酶家族已知成员有：乳酸氧化酶、乙醇酸氧化酶、扁桃酸氧化酶和长链α-羟酸氧化酶等。这些酶通常被用于外消旋α-羟酸的手性拆分(中国专利201210109290.4)。

发明内容

α-羟酸氧化酶拆分外消旋α-羟酸酯的步骤为：称取外消旋α-羟酸酯加入到反应器中使外消旋α-羟酸酯的初始反应浓度为1-40mM，再加入pH为4-10的反应缓冲液和α-羟酸氧化酶形成反应体系，α-羟酸氧化酶用量为1-100μg/ml，在20-50℃下水浴摇床150r/min振荡，反应时间为1-24小时，α-羟酸氧化酶氧化其对应的α-羟酸酯。按照此方法进行拆分，对映体过量高达到99.9％，产率最高接近50％。

产物(R)-α-羟酸酯的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价。

当采用L-α-羟酸氧化酶拆分时，得到光学纯的(R)-α-羟酸酯(D-α-羟酸酯)

对映体过量值％e.e＝[(S_R-S_S)/(S_R+S_S)]×100％

(R)-α-羟酸酯得率(％)＝(S_R/S₀)×100％

当采用D-α-羟酸氧化酶拆分时，得到光学纯的(S)-α-羟酸酯(L-α-羟酸酯)

对映体过量值％e.e＝[(S_S-S_R)/(S_R+S_S)]×100％

(S)-α-羟酸酯得率(％)＝(S_R/S₀)×100％

式中S_S为反应后(S)-对映体的峰面积，S_R为反应后(R)-对映体的液相色谱峰面积，S₀为反应前(S)-和(R)-对映体的液相色谱峰面积总和。

产物测定的液相色谱条件为：Chiralcel OD-H手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷：异丙醇：三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5mL/min，柱温25℃，检测波长210nm，进样量20μL。