[发明专利]应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法

权利要求书

1.一种应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法，其特征在于：具体步骤为：

步骤一、提取尿液中的DNA模板：

收集40ml尿液样本，在4℃、5000rpm 的条件下离心 10min，离心完成后收集底部的沉淀；

b、取1.5 ml TE 缓冲液，加入到步骤a收集的沉淀内，混合均匀后，在8000rpm 的条件下离心5min，离心完成后，收集底部的沉淀；

c、另取1.5 ml TE 缓冲液，加入到步骤b收集的沉淀内，混合均匀后，在8000rpm 的条件下离心5min，离心完成后，收集底部的沉淀；

d、取500ul裂解液和10 ul蛋白酶K加入到步骤c收集的沉淀内， 在55℃的条件下，水浴1小时，沉淀溶解，得到溶液；

e、将溶液取出，冷却至室温后，向溶液内加入等体积的饱和酚，混合均匀后，在5000 rpm的条件下离心10 min，离心完成后，弃上清；

f、加入432μL的氯仿和18μL的异戊醇，混匀，在5000 rpm的条件下，离心10 min，弃上清，得到混合液；

g、加入占步骤f制得的混合液1/10体积的3mol/L乙酸钠溶液，再加入2.5倍步骤f制得的混合液体积的无水乙醇，混合均匀后，在-20℃ 的条件下放置1h后，10000 rpm离心15min，弃上清；

h、加入500μL 70%的乙醇溶液洗涤2次，晾干后，加入50μL TE缓冲液，即完成了对尿液中 DNA的抽提，得到了DNA模板，在－20℃的条件下保存备用；

步骤二、制备ddPCR反应液：

室温条件下溶解PCR引物、blocker及TaqMan探针，并制备10x引物/ blocker/ TaqMan-MGB 引物预混液，其中，PCR上下游引物和blocker的浓度均为0.9 μmol/L，TaqMan探针的浓度为0.2 μmol/L，之后，将引物预混液、DNA模板、ddPCR SuperMix（Bio Rad）配置成20 μL ddPCR反应液，反应液的构成如下表所示：

；

步骤三、制备微滴：

将配好的ddPCR反应液加入到微滴发生板上，将微滴发生板装入到QX100八通道微滴发生器，在每个孔中加入70 μL微滴生成油来形成微滴；

步骤四、PCR扩増：

将样本生成的微滴手动转移到96孔PCR板上，孔板用锡箱热封，然后置于PCR仪中进行PCR扩増；

步骤五、检测微滴：

PCR扩增后，将96孔PCR板置于QX100微滴分析仪中，依次吸取每个样本中的微滴并随载液流逐一通过双色检测器，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性；

步骤六、分析数据以及显示结果：

采用QuantaSoft软件分析ddPCR数据确定等位基因分型，当样本中至少有2个微滴出现在FAM信号的阳性区域时，认为该样本此突变为阳性，否则为阴性。

2.根据权利要求1所述的一种应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法，其特征在于：所述的裂解液的组分构成为：10mM Tris-HCl ，1mM EDTA, 0.5% SDS。

3.根据权利要求1所述的一种应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法，其特征在于：所述的步骤二中，所述的引物预混液中，引物序列如下：

正向引物序列 F: 5`-AGATCACAGATTTTGGGCG-3`

反向引物序列 R: 5`-GAAAATGCTGGCTGACCTAAA-3`

TaqMan-MGB探针序列：5`-FAM-GTGCGGAAGAGAAAGAATACCATG-BHQ-3`

Blocker序列: 5`-ATCACAGATTTTGGGCT-PO4-3`。

4.根据权利要求1所述的一种应用数字PCR检测结直肠癌患者尿液中EGFR基因突变的方法，其特征在于：所述的步骤四中，检测的热循环模式为：95 ℃孵育10min；95℃15s， 63℃孵育1min，共45个循环；最后置于4 ℃中。