[发明专利]特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP‑RNAi表达盒及应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体是涉及一种提高玉米籽粒大小的方法。

背景技术

玉米是全世界最主要的禾谷类粮食和饲料作物之一，广泛应用于农业、工业及食品行业。由于胚乳占玉米籽粒重量80％-85％左右，胚乳细胞的分裂和发育状况决定着籽粒的重量和品质。而植物的胚乳发育是一个高度程序化的过程，在多个层面上受到精确调控，其发育及调控机制是生殖与发育生物学领域的前沿科学问题。

由于胚乳发育对玉米籽粒形成的重要性，近些年来，玉米胚乳发育的分子机理研究逐渐得到国内外研究者的关注。中国农业大学赖锦盛教授以及中国农业科学院张春义教授课题组分别研究发现，玉米胚乳的转录调控过程中存在大量的新转录区域，且多为胚乳组织特异性表达，除贮藏蛋白基因外，仍有大量差异基因的表达(Lai et al.2004；Lu et al.2013)。除从全基因组水平的研究外，细胞周期调控网络逐渐成为人们探讨玉米胚乳发育分子机理的研究热点。Leiva-Neto等研究发现，在玉米胚乳中特异性表达CDKA1-DN显性负相关等位基因，可使玉米胚乳胞内复制水平降至50％左右(Leiva-Neto et al.2004)。Sabelli等发现CYCA1；3在玉米胚乳发育游离核期大量表达，而CYCB1；3，D5；1和D2；1在胚乳发育中期高表达，说明不同亚族CYCs在玉米胚乳发育的不同阶段可能发挥不同的调控作用(Sabelli 2012)。同一课题组最近在PNAS杂志发表文章表明，在玉米胚乳发育的过程中，视网膜母细胞瘤相关蛋白(RBR)可负向调节CDKA；1活性，通过RNAi手段下调RBR1基因的表达，可以促进胚乳的细胞分裂和胞内复制(Sabelli et al.2013)。通过以上研究分析可知，玉米胚乳存在大量组织特异性表达基因，玉米胚乳发育各个时期，细胞周期相关调控蛋白的表达量及功能不尽相同。

细胞周期调控系统控制细胞的分裂，从而维持有机体的正常代谢和增殖，其核心成分是CDKs，这些激酶活性的周期性变化，控制着细胞周期进程。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDK inhibitors,CKIs)通过结合并抑制CDKs的活性来调控细胞周期进程，在阻止细胞分裂、响应环境信号等方面起着非常重要的作用(Morgan 1997)。植物CKIs与哺乳动物Kip/Cip家族具有较高的同源性，因此植物CKIs命名为Kip-related protein，简称为KRPs。KRPs对植物胚乳发育过程的调控作用已得到初步研究。如等人研究发现，过量表达Orysa；KRP1基因促使胚乳细胞核内复制水平下降，水稻种子内含物减少，胚乳细胞数量减少( et al.2006)。原位杂交分析表明Orysa；KRP3基因在水稻开花后第2天胚乳游离核期表达，但在开花后第5天胚乳细胞化期表达急剧下降，酵母双杂交实验证实Orysa；KRP3与Orysa；CKA1；1、Orysa；CKA2、以及Orysa；CYCD2；2互作，表明Orysa；KRP3可能参与调控水稻胚乳游离核期的细胞周期进程(Mizutani et al.2010)。

综合本领域的研究现状，KRPs在植物的不同组织及植物发育的不同阶段发挥着极其重要的作用，在调控植物胚乳发育过程中所发挥的重要功能也越来越凸显，但玉米胚乳游离核发育细胞周期进程的分子调控机制尚不明朗，通过抑制玉米KRP家族基因提高玉米籽粒大小的方法未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP-RNAi表达盒。

本发明的第二个目的是提供一种含有特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP-RNAi表达盒的质粒。

本发明的第三个目的是提供一种含有特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP-RNAi表达盒的质粒的细胞株系。

本发明的第四个目的是提供含有特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP-RNAi表达盒的质粒的细胞株系在提高玉米籽粒大小的应用。

本发明的技术方案概述如下：

特异性抑制玉米KRP基因在玉米胚乳中表达的KRP-RNAi表达盒，是由胚乳特异性启动子、SEQ ID No:1所示的核苷酸序列、SEQ ID No:3所示的核苷酸序列和SEQ ID No:1的反向序列组成，所述SEQ ID No:1所示的核苷酸序列、SEQ ID No:3所示的核苷酸序列和SEQ ID No:1的反向序列形成发夹结构。

胚乳特异性启动子的核苷酸序列优选SEQ ID No:2所示。