[发明专利]人ADAM15去整合素区域蛋白的制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种人ADAM15去整合素区域蛋白的可溶性重组表达及应用。

背景技术

整合素金属蛋白酶家族蛋白(a disintegrin and metalloproteinase，ADAM)，是一类锚定于细胞膜表面的跨膜蛋白。ADAM蛋白与蛇毒金属蛋白酶(snake venommetallop roteinase,SVMP)家族具有很高的同源性，其家族成员具有相似的结构，通常由800-1200个氨基酸组成，含有多个结构域。主要包括：前导域(pro-domain)、类金属蛋白酶功能域(metalloproteinase-like domain)、去整合素功能域(disintegrin-like domain)、富含半胱氨酸功能域(cysteine-rich domain)、类表皮生长因子功能域(epidermal growth factor-like domain)、锚定于细胞膜上的跨膜域(transmembrane domain)和C端的胞质尾区(cytoplasmic tail domain)。ADAM蛋白具有蛋白水解、细胞外基质降解、生物活性因子释放、细胞附着、融合、迁移、信号传导等功能，同时在炎症和肿瘤等病理过程也起重要作用。

ADAM15位于人类基因组的lq21.3染色体，由814个氨基酸组成。ADAM15是典型的ADAM家族成员，由信号肽区、前导区、金属蛋白酶区、去整合素区、富含半胱氨酸区、类EGF区、跨膜区及包浆尾段八个区域构成。ADAM15在多种肿瘤中表达上调，其在肿瘤进程中的作用及对抗肿瘤药物研究的指导的作用。

ADAM15具有蛋白水解酶活性，其活性主要依赖于在金属蛋白酶结构域中保守的锌离子结合序列HEXGHXXGXXHD。依赖于此金属蛋白酶活性ADAM15可以调控细胞的迁移。同时又有文献报道，ADAM15利用其蛋白水解酶活性可以释放多种跨膜蛋白衍生的EGFR配体，ADAM15的上调可增加配体脱落从而活化表皮生长因子受体从而增强在肿瘤的增殖过程中起到关键的作用的EGFR信号通路的传导而促进细胞的增殖。研究发现，在7种乳腺癌细胞中，ADAM15及E-cadherin的RNA水平都显著提高，ADAM15通过切割E-cadherin响应低血清压力，利用shRNA降低ADAM15的表达后，乳腺癌MCF-7细胞的增殖与对照组相比明显减慢，提示ADAM15对细胞增殖有积极作用。ADAM15在胃癌细胞中高表达，其抗体可抑制卵巢癌细胞的生长。综上可知，ADAM15在肿瘤中有高表达，降低ADAM15的表达或利用ADAM15的抗体会减慢细胞的增殖，提示ADAM15在肿瘤发展过程中可能起积极促进肿瘤生长作用。

ADAM15是ADAM家族中，唯一在去整合素区域含有RGD序列的蛋白。RGD存在于多种细胞外基质中，可与多种整合素结合。ADAM15的去整合素结构域，可以结合于与肿瘤血管新生密切相关的整合素家族(integrin)的粘附分子αvβ3、α5β1、和α9β1，干扰由αvβ3介导的肿瘤细胞对玻璃粘连蛋白的黏附，并减少了该细胞的运动能力。ADAM15的disintegrin-like区域重组表达蛋白在体外以依赖RGD结构的方式与αvβ3特异性相互作用，在体内外均表现出抑制肿瘤血管生成、肿瘤生长和转移的活性。近年来，重组表达ADAM15的去整合素区域蛋白并研究其活性的工作也广泛开展，重组ADAM15去整合素区域蛋白(rhddADAM15)的功能涉及细胞的粘附、迁移、血管生成细胞间相互作用等方面。

天然来源的ADAM 15蛋白非常有限，不能满足深入研究的需要。而且，作为含有七个结构域的跨膜糖蛋白，ADAM15结构的特殊性造成了获得具有生物活性的体外重组表达蛋白的困难。因此，获得高产量的ADAM 15蛋白是深入研究其抗肿瘤作用机相理的前提，同时也为ADAM 15发展成抗肿瘤药物提供可能。