[发明专利]一种基于Nafion修饰的玻碳电极检测凝血酶的方法

权利要求书

1.一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）使用传统的溶剂挥发法，将Nafion修饰到玻碳电极上，在玻碳电极上形成带有较强负电性的膜；

（2）设计凝血酶适配体DNA链及其互补链，并在适配体互补链一端修饰电活性物质―亚甲基蓝；

（3）DNA杂交反应，适配体链与其互补链混合杂交形成双链DNA结构；

（4）加入含有目标物凝血酶的待测样品，凝血酶与适配体链特异性结合，释放修饰有亚甲基蓝的DNA单链；

（5）DNA酶切反应，用Exo I酶酶解单链的标记有亚甲基蓝的DNA链，释放出连接有亚甲基蓝的DNA碎片；

（6）Nafion修饰的玻碳电极作为工作电极进行检测，多通路电信号读取装置检测并记录体系的电化学信号，分析凝血酶的含量。

2.根据权利要求1所述的一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法，其特征在于：步骤（1）中所述的Nafion的浓度为0.01wt.%，滴加体积为3.5 µL，使用传统的溶剂挥发法，置于室温下溶剂自然挥发进行修饰，储存备用。

3.根据权利要求1所述的一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的凝血酶适配体DNA链序列为：5′-GTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-3′。

4.根据权利要求1所述的一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的一端修饰亚甲基蓝的适配体互补链序列为：

5′-AGTCACCCCAACCTGCCCTACCAC-Methylene blue (MB)-3′。

5.根据权利要求1所述的一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的DNA杂交反应，在缓冲溶液中进行，使用的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

6.根据权利要求1所述的一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的DNA杂交反应，其中反应体系总体积为100 µL，凝血酶适配体DNA链的浓度为1 µM，修饰亚甲基蓝的互补链的浓度为1 µM。

7.根据权利要求1所述的一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的酶切反应，其中Exo I酶的使用量为20 U。

8.根据权利要求1所述的一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法，其特征在于：步骤（6）中使用Nafion修饰的玻碳电极作为工作电极进行检测，包括如下步骤：

（1）将凝血酶适配体DNA链与修饰亚甲基蓝的互补DNA链混入含1 mM DTT的Tris-HCl缓冲体系中，在37℃下反应1小时；

（2）加入含有凝血酶的待测样品和Exo I酶混合，在含1 mM DTT的Tris-HCl缓冲体系中37 ℃下反应1小时；

（3）使用Nafion修饰的玻碳电极进行检测，用多路输出电化学工作站进行DPV示差脉冲电信号的收集；通过DPV电信号的变化趋势来监测凝血酶浓度。