[发明专利]一种细胞培养基和培养基补充物

说明书

一方面，本发明涉及一种本质上无血清白蛋白，化学成分明确的培养基，其高效支持干细胞分化，极大提高实验重复性，并可长期培养分化的细胞。在具体的实施例中，本发明提供了促进干细胞分化为心房和心室心肌细胞的组合物和方法。本发明进一步涉及由干细胞分化心房和心室心肌细胞，和这些心肌细胞的使用，例如，心肌受损修复，新药开发期间的心脏安全性评估，和筛选用于心肌受损的新疗法。

一.技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种干细胞培养和使其分化能力增强的组合物和方法。本发明提供了提高干细胞心肌分化效率并促进心房和心室心肌细胞形成的组合物和方法，涉及从干细胞分化心房和心室心肌细胞，和这些心肌细胞的应用，如，心肌受损修复及筛选心肌损伤的新治疗方法。

二.背景

由于具有无限增殖和有效分化为心肌细胞的能力^1，2，人多能干细胞(hPSCs)为研究人的心脏发育和心脏疾病、药物开发，尤其是未来心脏细胞替代治疗充血性心力衰竭开辟了一条新途径^3，4。为了实现这些前景，尤其是这些细胞的临床应用，必须在符合生物安全监管要求的培养条件下大量重复生产心肌细胞，特别是心室肌细胞⁵。

hPSCs心肌分化及培养条件是当前hPSC-CMs安全治疗应用的障碍之一。hPSCs最初以鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层，培养在牛血清替代物中⁴。在细胞移植疗法中，细胞培养系统中使用的动物或人的产品引起人们对潜在病毒，支原体，和朊病毒传播到细胞的担心，必须进行全面的筛选试验，以排除这些感染传播给细胞移植接受者的风险，并满足临床监管要求⁵。目前大多数用于心肌分化的培养系统都包含动物组分^1，2。最近，使用重组人白蛋白建立化学成分明确的心肌分化培养基取得了显著进展^6，7。然而，除去成本和白蛋白的批次差异，大量的重组人白蛋白(5mg/mL⁶，0.5mg/mL⁷)可能会导致大量杂质进入培养系统。如果这些污染物质和细胞一起移植，人们将会担心这些污染物在移植患者体内诱发不利的免疫反应。因此，有必要对临床用的干细胞培养组成成分和方法进行优化。

三、发明概述

该概述不用于限制本发明的权利要求范围。本发明的其他技术特征，细节，实用性和优点将在本发明具体实施方式中显现，包括以附图和附加权利要求的方式公开。

为了开发一种无血清白蛋白，化学组分明确的心肌分化培养基，对在人胚胎干细胞诱导心肌分化中广泛使用的一种培养基补充物B27的动物源成分(包括白蛋白)和非必需成分进行系统性去除^2,9，并且补充抗氧化剂以维持高效的细胞增殖和心肌分化能力。为期10个月的心肌分化实验数据显示，使用配制的无血清白蛋白、成分明确的培养基(S12培养基)分化心肌，相比于使用了B27补充物的培养基心肌分化效率提高了20.9％，心肌细胞得率提高48.6％，并且组间差异减少了57％。S12培养基不仅支持在二维培养瓶中大规模培养心肌细胞，还可以长期培养心肌细胞(超过100天)。在无血清白蛋白、组分明确的培养条件下用E8培养系统和S12培养基，可以获得新的hiPSC细胞系，并增殖分化得到高度均一的心房和心室肌细胞。电生理结果显示，获得的心室肌细胞适用于心肌药物安全性评价。

一方面，一种细胞培养基补充剂，其包括一种替代培养基中血清白蛋白功能的抗氧化剂。一方面，在此公开一种细胞培养基补充剂，其包括至少两种抗氧化剂的组合，替代培养基中血清白蛋白的功能。一方面，在此公开一种细胞培养基补充剂，其包括至少三种抗氧化剂的组合，替代培养基中血清白蛋白的功能。

在前面的任一项实施例中，本文公开的细胞培养基补充剂可包含从以下组中选择出来的至少一种抗氧化剂：a)抗坏血酸，抗坏血酸盐，或其酯，b)一种维生素E的水溶性类似物，c)N-乙酰半胱氨酸，或谷胱甘肽，或其盐或其酯，d)丙酮酸，丙酮酸盐，或其酯。其中细胞培养基补充剂配制于基础培养基中，就可以形成本质上无血清白蛋白细胞培养基。