[发明专利]核酸甲基化的确定

说明书

本发明涉及用于确定样品中靶核酸分子的甲基化状态的方法和试剂盒，其包括：(a)用亚硫酸氢盐处理所述靶核酸；(b)用甲基化特异性引物扩增经处理的靶核酸；(c)使扩增子与甲基化特异性等离子体纳米探针接触；以及(d)基于杂交探针和所述靶核酸的解链温度T_m，确定所述甲基化状态。特别地，等离子体金纳米颗粒共价偶联至吗啉代寡核苷酸探针。本发明还请求保护用于确定Septin 9(SEPT9)基因启动子的甲基化状态的方法和试剂盒。

本申请引用2015年11月27日提交的新加坡专利申请No.10201509792S并要求其优先权权益，根据PCT细则4.18，其内容通过引用出于所有目的并入本文，包括并入本文未包含的、根据PCT细则20.5(a)涉及的任何说明书、权利要求或附图的要素或部分。

技术领域

本发明一般涉及检测DNA甲基化的方法和试剂盒。

背景技术

人类基因的表观遗传修饰有望成为癌症早期诊断的有前途的生物标志物。特别地，癌症抑制基因的启动子区域的DNA甲基化通常与参与癌症倾向性(predisposition)、起始和进展的异常基因调控有关。因此，DNA甲基化生物标志物可为癌症早期检测和癌症进展监测的理想靶标。

例如，最近的研究表明，基于血液的Septin 9(SEPT9)基因甲基化检测可用作结肠直肠癌的非侵入性筛查方法。从肿瘤细胞释放的循环无细胞DNA(cell-free DNA，cfDNA)片段允许异常DNA改变的早期检测。据报道，SEPT9试验的临床灵敏性和特异性可高于70％。与基于结肠镜的监测相比，DNA测定方便得多，并且能提高患者对筛查的顺从性。然而，在正常DNA的大背景下测量稀有循环肿瘤cfDNA的表观遗传变化是非常具有挑战性的。需要高度灵敏和特异性的检测。

现有技术中已经存在用于确定核酸甲基化的多种技术。但是，对于新技术仍然有相当大的需求，以克服现有技术的缺陷。

发明内容

本发明通过提供用于测定核酸甲基化的新方法来满足本领域的上述需求。

在一方面中，本发明提供了确定样品中靶核酸分子的甲基化状态的方法，其中所述方法包括以下步骤：

(a)用亚硫酸氢盐处理所述样品，从而将所述靶核酸分子中未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶；

(b)在聚合酶链式反应(PCR)中，使用甲基化特异性引物对，在允许产生PCR扩增产物(扩增子)的这样的扩增条件下，扩增经转化的靶核酸分子的至少一部分，所述部分包含待分析甲基化状态的靶区域；

(c)在允许寡核苷酸类似物探针与包含所述靶区域的所述扩增子彼此杂交的条件下，使所述扩增子与甲基化特异性等离子体纳米探针接触，所述等离子体纳米探针包含等离子体纳米颗粒和与其共价偶联的非离子寡核苷酸类似物探针，所述寡核苷酸类似物探针包含与所述靶区域互补的碱基序列，其中如果与所述靶核酸分子杂交，则所述探针产生与未杂交探针的信号可区分的可检测信号；

(d)基于对所述纳米探针和所述靶核酸的杂交体的解链温度T_m的测定，来确定所述靶核酸分子的甲基化状态。

在多个实施方案中，确定了靶核酸分子内的一个或更多个CpG岛的甲基化状态。

在多个实施方案中，在本文公开的方法的步骤(b)中使用不对称PCR(asymmetricPCR，aPCR)。

在多个实施方案中，甲基化特异性引物的至少一个在包含一个或更多个CpG岛的区域处与转化的靶核酸分子杂交，使得在PCR期间，与经转化的未甲基化分子，引物对更倾向于与经转化的甲基化核酸分子杂交。

在多个实施方案中，在PCR期间添加阻断剂(blocker)序列以使经转化的未甲基化核酸分子的扩增最小化。