[发明专利]一种用于制备三维软骨类器官块的方法

说明书

本发明提供通过将间充质干细胞分化成三维球状软骨组织，三维软骨球状块的基本单位，而制备的三维软骨类器官块。发明人发现，GAG基质的量和胶原蛋白2型的表达均增加。因此，本发明的方法通过根据二维培养物有效地增强软骨分化构建体的功能来提供临床上可应用的软骨组织。所述三维软骨类器官块可以有用地应用于诸如，需要软骨组织恢复的关节软骨再生和整形手术的领域。

技术领域

本发明涉及制备人造组织。本发明直接涉及体外制备人造软骨组织的方法。

背景技术

老龄化以及社交和体育活动的增加导致患有软骨损伤的患者数量增加，因此开发恢复受损软骨的医学技术的需求也在增加。然而，由于软骨组织没有血管并且软骨细胞的运动性受到细胞外基质(ECM)的限制，所以难以轻松地使受损的软骨再生。

在目前治疗受损软骨的方法中，人造关节置换具有缓解疼痛的优点，并且在成功完成手术时能使患者自然地行走。由于与人造关节置换相关的技术近来得到了很大的改进，人造关节置换手术被用于治疗严重损伤的软骨。此外，微创人工关节置换手术有助于人工关节的寿命延长并从手术中快速恢复。然而，人造关节手术在各个方面仍然是患者的负担。人造关节的磨损限制了人造关节的寿命，并且耐用性取决于管理和手术的结果。进一步地，如果手术过程中存在细菌感染，则需要再次手术。进一步地，在骨切割手术期间存在副作用或并发症的风险。因此，对使用细胞(employee cells)的再生医疗解决方案的需求不断提高。在这方面，已经开发了使用从患者自身获得的细胞进行自体软骨细胞植入(aci)、异体软骨细胞植入以及通过将自体和/或异种干细胞分化为软骨细胞来开发治疗剂的研究。

自体和/或异体软骨细胞植入具有由软骨细胞培养引起的去分化问题，因此无法获得用于有效治疗的足够数量的细胞。使用间充质干细胞的治疗具有提供足够数量的细胞的优点。尽管目前还没有完善的软骨分化方法，但近来已经开发了大量技术。应当开发诸如软骨细胞生存力增强、表型维持和机械强度保持等技术，以使得使用细胞的治疗方法成功。迄今为止，已经引入了各种方法以克服上述问题(韩国专利登记No.10-1367221)，例如通过使用三维支撑物(诸如，水凝胶)来增强细胞粘附率，通过控制周围微环境来维持更多天然软骨组织，保持对外部压力的弹性。然而，诸如细胞和生物材料之间的相互作用、生物相容性以及尤其是与邻近软骨的结合等问题尚未解决。

近来，在不使用支持物的情况下，细胞被制备成高密度三维小球。这种球状体成形方法具有制备工艺简单和容易重复的优点。尽管开发了使用96孔的细胞群培养技术，其在每个单孔中包含一个球状体，但是很难在结构上形成球状体彼此融合处的一个组织。用诸如水凝胶的生物材料制备软骨组织是不可能的，因此难以用常规技术制备治疗剂。KR专利No.10-1109668公开了使用介孔PLGA-二氧化硅支架，从脂肪干细胞分化的骨用于组织工程，KR专利No.10-0839875公开了关于用于关节软骨再生的支架的发明，其中，支架是通过将细胞接种到包含可生物降解聚合物和磷酸钙生物相容性陶瓷的介孔支架中而制备。

发明内容

发明人已经研究了用于制备三维软骨类器官块的新方法以解决上述问题。结果，我们首先发现，在相互接触的三维球状软骨组织分化为软骨的情况下，组织彼此连接以提供大的三维软骨类器官块。其次，当通过将三维球状软骨组织(间充质干细胞构建体或在间充质干细胞向软骨细胞分化的中间步骤中的构建体)加载在二维高密度软骨分化细胞层(间充质干细胞或由间充质干细胞分化的软骨细胞的中间状态的细胞层)的中心部分上，来持续诱导软骨分化时，我们发现二维高密度软骨分化细胞层自组装以环绕三维球状软骨组织，从而形成结构致密的三维软骨类器官块。

就此而言，本发明提供了一种制备三维软骨类器官块的方法，其通过融合和连接三维球状软骨组织本身，或通过在三维球状软骨组织存在下诱导二维软骨分化细胞层的自组装，所述三维球状软骨组织通过间充质干细胞分化成三维球体状态软骨组织而制备，其中通过在二维平板上将间充质干细胞分化成高密度软骨组织来制备二维软骨细胞层。

另外，本发明的目的是将三维软骨类器官块用于需要软骨修复的任何区域或领域。