[发明专利]使核酸移位通过纳米孔的方法

权利要求书

1.一种分析核酸的方法，包括：

在反应混合物中使具有5'非互补尾部的引物在模板上延伸以产生包含标记的延伸链和作为单链突出端的所述5'非互补尾部的双链产物；

提供至少一个纳米孔，所述至少一个纳米孔提供在第一室和第二室之间的流体连通，其中所述至少一个纳米孔的每个纳米孔能够使单链核酸而不是双链核酸通过；

将所述双链产物布置在所述第一室中；

通过施加跨所述纳米孔的电场，使所述双链产物的5'非互补尾部被所述至少一个纳米孔捕获；

通过施加的电场以小于1000个核苷酸/秒(nt/sec)的速率使捕获的双链产物的标记的延伸链移位通过所述纳米孔，其中随着所述双链产物的移位链进入所述纳米孔，所述双链产物的移位链被解链。

2.如权利要求1所述的方法，还包括在将所述双链产物布置在所述第一室中的所述步骤之前分离所述双链产物的步骤。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述延伸链被标记。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述标记是光学标记。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个纳米孔构成多个纳米孔的阵列。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述多个是至少100个。

7.如权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：将包含已知双链部分和作为单链突出端的5'非互补尾部的预定标准物布置在所述第一室中；以及选择跨所述至少一个纳米孔施加的电场强度，所述电场强度对应于所述小于1000个核苷酸/秒的移位速率。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述双链产物在所述双链产物的与所述5'非互补尾部相同的末端处还包含3'突出端，并且其中所述3'突出端的长度短于所述5'非互补尾部。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述双链产物在所述双链产物的与所述5'非互补尾部相同的末端处还包含3'突出端，并且其中所述方法还包括用3'单链外切核酸酶处理所述双链产物的步骤以在所述捕获步骤之前去除所述3'突出端。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述标记的延伸链的标记是光学标记，每个光学标记能够产生指示该光学标记附着至其的核苷酸的光学信号，并且其中所述方法还包括随着所述标记的延伸链通过所述纳米孔，检测来自所述光学标记的光学信号的步骤。

11.一种分析核酸的方法，包括：

在反应混合物中使引物在模板上延伸以产生包含具有游离的3'-羟基的标记的延伸链的双链产物；

通过末端转移酶活性在无模板的情况下进一步延伸所述延伸链以在所述双链产物上产生3'-单链尾部；

提供至少一个纳米孔，所述至少一个纳米孔分隔第一室和第二室并提供在第一室和第二室之间的流体连通，其中所述至少一个纳米孔的每个纳米孔能够使单链核酸而不是双链核酸通过；

将具有3'单链尾部的双链产物布置在所述第一室中；

通过施加跨所述纳米孔的电场，使双链产物的3'单链尾部被所述至少一个纳米孔捕获，

通过施加的电场以小于1000个核苷酸/秒(nt/sec)的速率使捕获的双链产物的标记的延伸链移位通过所述纳米孔，其中随着所述双链产物的移位链进入所述纳米孔，所述双链产物的移位链被解链。

12.如步骤11所述的方法，其中所述标记的延伸链的所述标记是光学标记，每个光学标记能够产生指示该光学标记附着至其的核苷酸的光学信号，并且其中所述方法还包括随着所述标记的延伸链通过所述纳米孔，检测来自所述光学标记的光学信号的步骤。