[发明专利]悬浮培养驯化粘附型细胞的制备方法、粘附型上皮细胞的上皮间叶转化诱导方法及其利用

说明书

本发明为：驯化成悬浮培养的粘附型细胞的制备方法，其具有将粘附型细胞在与含脂环结构聚合物成型体接触的状态下进行培养的工序；由外来基因编码的核酸或蛋白质的生产方法，其基于以下方式进行，即通过该方法培养上述驯化成悬浮培养的粘附型细胞；由含脂环结构聚合物成型体形成的粘附型细胞的悬浮培养驯化促进剂；用于使粘附型细胞驯化成在液体培养基中悬浮培养的、含脂环结构聚合物成型体的使用；至少底面由含脂环结构聚合物成型体形成的粘附型细胞的悬浮培养驯化用容器；上皮间叶转化的诱导方法，其具有将粘附型上皮细胞在与含脂环结构聚合物成型体接触的状态下进行培养的工序；由外来基因编码的核酸或蛋白质的生产方法，其基于以下方式进行，即通过上述诱导方法培养经上皮间叶转化的粘附型细胞；等。

技术领域

本发明涉及驯化成悬浮培养的粘附型细胞的制备方法。此外，本发明涉及粘附型上皮细胞的上皮间叶转化的诱导方法。

背景技术

近年来，代替由低分子化合物形成的医药品，副作用少的生物医药品的研究盛行。生物医药品为通过基因重组技术所制造的重组医药品。例如，作为重组医药品，已知将用于癌治疗、风湿治疗的抗体、作为用于增加红血球的激素的促红细胞生成素(EPO)等蛋白质作为成分的重组医药品。

然而，重组医药品有时用于治疗的给药量多且用于生产的费用高，还没有充分普及。因此，提高生产率成为一个问题。

重组医药品可通过例如下述方法生产：以在CHO(中国仓鼠的卵巢；ChineseHamster Ovary)细胞等粘附型细胞中导入目标蛋白质的基因、在悬浮状态下进行增殖的方式，制备重组CHO细胞，在该重组CHO细胞内使目标蛋白质生物合成。通常，细胞在悬浮培养系统中粘附型细胞的平均倍增时间变迟。因此，为了提高增殖能力需要驯化成适于悬浮培养环境的操作。

作为使粘附型细胞驯化成悬浮培养的方法，例如专利文献1中记载了下述方法：通过将编码目标蛋白质的基因和具有二氢叶酸还原酶基因的质粒向CHO细胞中进行基因导入，将得到的重组CHO细胞在与通常相比细胞密度低的条件下反复进行培养，从而将重组CHO细胞在悬浮状态下进行培养。

然而，由于该方法为反复进行培养直到使CHO细胞成为悬浮状态的方法，因此需要8周左右的长时间。此外，当传代培养时间变长时，会增加对基因的变异、细胞的变质等状态进行管理、确认的劳力和时间以及费用。

此外，专利文献2中记载了通过在二氢叶酸还原酶基因缺陷型细胞株中重组人抗凝血酶基因和二氢叶酸还原酶基因，使用中空纤维型培养装置培养成为了悬浮状态的重组CHO细胞，从而一边使该细胞悬浮一边制造人抗凝血酶的方法。

然而，在该方法中，由于安装有中空纤维的装置复杂且价格昂贵，因此有费用方面的问题。此外，当为了大量培养而使中空纤维的尺寸变大时，在中空纤维两端的培养基交换不均等，培养基容易变得不均匀。结果，由于培养基的pH等发生变化、中空纤维内的细胞受到压力，因此目标蛋白质的生产率可能降低。

此外，上皮间叶转化(Epithelial-Mesenchymal Transition(Transformation)；EMT)为在发育、创伤治愈以及癌的浸润、转移等生命现象中所观察到的上皮细胞的性质转化为间叶细胞的性质的过程。通过上皮间叶转化从而细胞表达的某种蛋白质发生变化。将这样的蛋白质称为上皮间叶转化标记，基于上皮间叶转化的诱导从而存在表达量增加的上皮间叶转化标记(上调，up regulation)和表达量减少的上皮间叶转化标记(下调，downregulation)。例如，作为表达量增加的上皮间叶转化标记，已知N-钙粘蛋白、波形蛋白，作为表达量减少的上皮间叶转化标记，已知E-钙粘蛋白、细胞角蛋白(专利文献3)。此外，由于上皮间叶转化会被TGF等生长因子诱导，因此TGF等生长因子作为上皮间叶转化诱导因子而为人所知(非专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平2-009388号公报；