[发明专利]通过遗传编程的多谱系造血前体细胞产生

说明书

本公开内容大体上涉及用于从多能干细胞(PSC)提供多谱系造血前体细胞的方法和组合物。PSC包含编码ETS/ERG基因、GATA2和HOXA9的表达构建体。还提供了用于提供能够在哺乳动物(例如人)中长期植入的造血干细胞的方法。进一步提供了治疗组合物，包括所提供的造血干细胞和造血细胞的前体，以及使用它们治疗受试者的方法。

本申请要求于2015年10月20日提交的美国临时申请系列号62/244,101以及2016年10月5日提交的系列号为62/404,470的优先权，两个申请的全部内容通过引用并入本文。

发明背景

1.发明领域

本发明一般涉及分子生物学、干细胞和分化细胞领域。更具体地，涉及将多能干细胞(PSC)编程为特定细胞谱系，特别是造血细胞和造血细胞前体。

2.相关技术的描述

造血干细胞(HSC)是唯一具有自我生命更新、分化成所有血细胞类型和在移植后重建整个造血系统的能力的细胞。这些细胞以及它们的终末分化的衍生细胞类型如红细胞、血小板、粒细胞和淋巴样细胞在治疗各种血液疾病和最近治疗癌症方面具有完善的治疗应用。然而，来自HLA匹配的活体供体的HSC的有限的可用性对其在诊所广泛使用提出了很大限制。因此，已经做出相当大的努力来从替代细胞类型衍生HSC。

从替代细胞类型衍生HSC的一种方法是将非HSC体细胞类型转分化为HSC。已经使用各种转基因组合将小鼠成纤维细胞转分化为非可植入的造血祖细胞(Pereira等，2013；Batta等，2014)。然而，由于起始原代细胞的数量以及低转分化效率，这种方法受到限制。因此，缺乏提供具有长期植入潜能的造血前体细胞的无限供应的方法。

人胚胎干细胞(ESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)能够在体外无限增殖，同时保留分化成所有体细胞类型的潜能。因此，人ESC和iPSC可潜在地为体外和体内应用提供无限量的患者特异性HSC和功能性血细胞供应。人PSC向造血谱系细胞的体外分化概括了正常的体内发育，包括中胚层诱导的阶段和多能造血前体的特化。因此，已经开发出许多方法来通过正向编程将人PSC分化为造血谱系。

然而，目前还没有任何方法可以从PSC强有力地生成能够实现高效的髓样和淋巴样分化以及长期植入的HSC，这主要是由于造血个体发育的复杂性质。在一种方法中，过表达转基因如HoxB4和Lhx2用于小鼠PSC的造血分化已显示产生可植入的HSC样细胞(Kyba等，2002；Kitajima等，2011)。然而，这些转基因未能从人PSC产生HSC。在另一种方法中，Doulatov等人报道在人PSC中ERG、HOXA9、RORA、SOX4和MYB转基因的组合能够产生能够进行髓样和红细胞分化的造血祖细胞(Doulatov等，2013)。然而，该方法仅产生能够依赖于持续转基因表达的短期植入的细胞。因此，虽然遗传编程被证明是一种非常有前景的方法，但缺乏允许从人PSC在体外强有力地生成能够实现淋巴样和髓样潜能以及长期植入的造血前体细胞的方法。

发明概述

本公开内容的实施方案提供了将人多能干细胞有效编程为多谱系造血祖细胞的方法。在第一个实施方案中，提供了用于从多能干细胞产生造血前体细胞(HPC)的体外方法，其包括提供包含至少一种编码造血前体编程基因的表达构建体的多能干细胞(PSC)，其中造血前体编程基因包括ETS/ERG基因、GATA2和HOXA9，并且在表达造血前体编程基因的条件下培养多能干细胞，由此产生造血前体细胞。在某些方面，HPC能够分化成髓样和淋巴样谱系。在一些方面，多能干细胞是胚胎干细胞(ESC)或诱导的多能干细胞(iPSC)。在某些方面，多能干细胞是人的多能干细胞。

在某些方面，表达构建体是基于转座子或游离体的表达构建体。在一些方面，造血前体编程基因处于单个启动子的控制下。在特定方面，单个启动子是诱导型启动子。在具体方面，诱导型启动子是四环素诱导型启动子。