[发明专利]用作整合脂质双层的纳米孔的蛋白质变体及其方法

说明书

本公开的主题涉及可以引入脂质膜以形成导电孔并且可以提供用于本文所述的其它用途的工程化T3或T4病毒DNA包装马达连接子蛋白。

政府利益

本公开的主题是在由国家卫生研究院授予的R01EB012135号基金的政府支持下作出的。政府对本发明具有一定的权利。

相关申请

本专利申请要求2015年9月18日提交的美国专利申请号62/220,545的权益，其内容通过引证以其全整体并入本文。

技术领域

本公开的主题涉及可以引入脂质膜以形成导电孔并且可以提供用于本文描述的其它用途的工程化的T3和/或T4病毒DNA包装的马达连接子蛋白。

背景技术

DNA易位马达(translocation motor)在所有生物系统中普遍存在(1-6)。在复制期间，双链DNA(dsDNA)病毒的基因组包装到被称为前头(prohead)的预先形成的蛋白中至与晶体DNA类似的密度(7)。该过程从熵的角度是不利的并且需要强力的包装马达以完成该任务。许多dsDNA噬菌体和疱疹病毒中的包装马达的组分包括被称为连接子或门顶点(protal vertex)的蛋白质通道。其位于衣壳和ATP酶环之间。pRNA是基因组DNA包装所需的噬菌体phi29中的独特组分(8，9)。结构研究显示来自疱疹病毒和不同的有尾噬菌体，如phi29、SPPI、T4和T3的连接子享有类似的锥形十二聚体结构(图1)，即使它们的一级序列没有显示同源性。连接子蛋白在基因组包装和释放过程中起重要作用。在病毒组装期间，连接子起到马达ATP酶的对接点和dsDNA转运的管道的作用。在DNA包装后，连接子则用作尾部组分的结合位点以完成病毒粒子组装。当噬菌体开始感染时，DNA通过同轴的连接子和尾部通道释放到宿主细胞中。

近期研究表明噬菌体phi29的DNA易位酶使用“通过单向阀的循环”(10-12)而不是旋转(13)来包装DNA，而T4使用“扭转压缩”机制(14，15)。由于通道像单向阀一样作用，明显的问题是如果通道是单向向内的阀，则在感染过程中dsDNA如何释放。上述研究揭示了未能解释的现象，在DNA酶消化后，在phi29和T3中，包装中间体或不完全包装的DNA总是显示出三条主带(16，17)。之前的研究已表明在DNA包装和释放过程中，连接子进行构象变化。例如，研究之一显示由DNA、pRNA或二价金属离子引起phi29连接子的构象变化，如通过圆二色谱和内源色氨酸荧光的淬灭所显示(18，19)。低温EM还显示出游离的体外连接子和感染性病毒粒子中的连接子的构象变化(20)。然而，这些研究都没有显示出在单分子水平上构象变化。

纳米孔技术是具有用于多种应用，包括检测小分子、大分子、分子结合、蛋白折叠和DNA测序的潜力的新兴领域(21-28)。已将再工程化的phi29 gp10连接子插入脂质双层，其显示出可以经受各种溶液条件，包括pH 2-12，和0.1-3M NaCl或KCl的离子强度的高度稳健的性质(29，30)。连接子通道向脂质膜的插入导致了电流均匀的步进增加，并且通道在正和负电压下显示出相等的电导(29)。通过在通道内部或末端引入适当的探针，可以基于电流特征检测超低浓度的单种化学品或单种抗体(31，32)。通道允许dsDNA易位(10，11，29，33-36)并且能够区别具有适当修饰的ss-DNA和RNA(34)。此外，phi29连接子通道在DNA包装中显示出具有阀门机制的对dsDNA易位的单向通行性质(10，11)和电压引起的通道门控(gating)(35)。对噬菌体T3、T4、SPPI和Phi29的DNA易位酶常见的通道构象变化的发现支持了单向流入通道在DNA释放过程期间被转换为流出通道的观察。

发明内容

在研究了本文档中所提供的信息之后，对本领域普通技术人员显而易见的，本公开的主题满足了上述需求中的一些或全部。