[发明专利]靶核酸的定量方法和用于该方法的试剂盒

说明书

本发明的目的在于提供不实施连接反应、并且消除由PCR扩增效率引起的问题、兼顾靶核酸的测序和靶核酸的定量的方法。上述目的通过下述方法得以解决：(1)使用导入有对靶核酸的序列具有特异性的序列并且在其上游导入有随机序列和已知序列的引物，实施单引物延伸反应，由此得到具有随机序列和靶核酸的序列的双链核酸；(2)以所得到的双链核酸作为模板，使用对已知序列具有特异性的引物和具有靶核酸的序列的一部分的引物实施PCR，由此得到具有随机序列和靶核酸的序列的双链核酸的扩增物；(3)使用所得到的双链核酸的扩增物，进行测序，将随机序列与靶核酸的序列一同进行解读。

相关申请的相互参考

本申请要求2015年11月18日提交的日本特愿2015-225671号的优先权，其全部记载作为公开内容援引于此。

技术领域

本发明涉及包含被保守区包围的对象序列的靶核酸进行定量的方法和用于该方法的试剂盒。

背景技术

通过第二代测序技术的开发，同时进行多个测序成为可能，因此，基因的网罗性解读变得实用。在测序时，通常通过PCR将包含作为标靶的基因的核酸扩增至可进行序列的检测的程度。

若应用第二代测序技术，理论上能够对试样中的靶核酸的相对量(比例)进行定量。但是，实际上根据由测序得到的序列文库中的靶核酸的比例推测试样中的靶核酸的拷贝数是较为困难的。这是因为，核酸的基于PCR的扩增效率根据核酸的序列、GC含量、二级结构等而有所差异。因此，通常采取在测序之外另行通过实时PCR等对靶核酸进行定量的方法。

作为消除这种由PCR扩增效率引起的问题、兼顾靶核酸的测序和靶核酸的定量的方法，例如，在下述专利文献1和非专利文献1(该文献的全部记载作为公开内容援引于此)中，记载了下述方法：以在靶核酸的末端连接有由共有序列和可变序列构成的接头序列的序列作为模板，使用具有与该共有序列互补的序列的引物实施PCR，接着对扩增产物的序列进行确认，由此，基于可变序列的种类及其数量算出靶核酸的拷贝数。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利申请公开第2011/0160078号说明书

非专利文献

非专利文献1：Glenn K.Fu et al.,PNAS,May 31,2011,vol.108,no.22,pp.9026-9031

发明内容

发明所要解决的问题

但是，专利文献1和非专利文献1中记载的方法中，在通过连接反应在靶核酸的末端附加特定序列时，为了实施连接反应，必须通过先进行限制酶处理而使靶核酸的末端为突出末端。因此存在如下问题：根据靶核酸的序列，难以或不可能进行突出末端化，进而，突出末端化的效率受到基于限制酶的切割效率的影响。

因此，本发明所要解决的课题在于提供不实施连接反应、并且消除由PCR扩增效率引起的问题、兼顾靶核酸的测序和靶核酸的定量的方法。

用于解决问题的方法

本发明人为了解决上述课题而反复进行了深入研究，结果，成功地创制了下述方法：(1)使用导入有对靶核酸的序列具有特异性的序列并且在其上游导入有随机序列和已知序列的引物，实施单引物延伸反应，由此得到具有随机序列和靶核酸的序列的双链核酸；(2)以所得到的双链核酸作为模板，使用对已知序列具有特异性的引物和具有靶核酸的序列的一部分的引物实施PCR，由此得到具有随机序列和靶核酸的序列的双链核酸的扩增物；(3)使用所得到的双链核酸的扩增物，进行测序，将随机序列与靶核酸的序列一同解读。此外，本发明人还发现，根据本方法，能够在靶核酸的测序的同时利用随机序列的多样性对靶核酸的拷贝数进行定量。