[发明专利]核酸酶DSB的完全查询和测序(FIND-SEQ)

权利要求书

1.一种制备共价闭合DNA片段的文库的方法，该方法包括：

提供DNA，优选来自目的细胞类型或生物体的基因组DNA(gDNA)；

任选地将所述DNA随机剪切至限定的平均长度，优选约200个碱基对至1000个碱基对(bp)的平均长度，以提供DNA片段群；

制备用于末端连接的片段，优选地通过对剪切的DNA进行末端修复，并且然后对其加A尾；

将至少包含单一脱氧尿苷和第一引物位点的第一发夹衔接子连接至所述片段的末端以制备连接片段群；

使所述连接片段与诱导双链断裂的核酸酶接触；以及

用外切核酸酶纯化所述连接片段，由此制备共价闭合DNA片段的文库。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一引物位点在PCR引发和/或测序，优选下一代测序(NGS)中可兼容使用。

3.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括使所述共价闭合DNA片段的文库与核酸酶接触以诱导双链断裂，优选包括位点特异性切割；

连接至少包含单一脱氧尿苷和与所述第一引物位点在PCR引发和/或测序中可兼容使用的第二引物位点的第二发夹衔接子；

使所述文库与酶接触以在所述脱氧尿苷处使所述DNA产生缺口；以及

对具有第一和第二发夹衔接子的那些片段进行测序。

4.如权利要求3所述的方法，其中在所述脱氧尿苷处使所述DNA产生缺口的酶是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)或内切核酸酶VIII。

5.一种制备包含核酸酶诱导的DNA双链断裂的片段的文库的方法，该方法包括：

提供DNA；

将所述DNA随机剪切至限定的平均长度，优选约200个碱基对至1000个碱基对(bp)的平均长度；

任选地对剪切的DNA进行末端修复，并且然后对其加A尾；

连接第一发夹衔接子至所述DNA，所述第一发夹衔接子优选地包含具有约10至20个核苷酸的第一区域；具有约45至65个核苷酸的第二区域，所述第二区域形成一个或多个发夹环并且包含在PCR引发和/或测序中可兼容使用的第一引物位点；和具有约10至20个核苷酸的第三区域，所述第三区域与所述第一区域互补，在所述第一和第二区域之间具有单一脱氧尿苷核苷酸；

使样品与一种或多种外切核酸酶接触，足以降解任何缺少连接到其两个末端的第一发夹衔接子的DNA分子；

用核酸酶处理所述样品以诱导位点特异性切割；

任选地对产生的末端进行末端修复，并且然后对其加A尾；

连接第二发夹衔接子，所述第二发夹衔接子包含具有约10至20个核苷酸的第一区域；具有约40至60个核苷酸的第二区域，所述第二区域形成一个或多个发夹环并且包含与所述第一引物位点在PCR引发和/或测序中可兼容使用的第二引物；和具有约10至20个核苷酸的第三区域，所述第三区域与所述第一区域互补，并且在所述第二和第三区域之间也含有单一脱氧尿苷核苷酸，以产生其中被核酸酶切割的DNA片段具有连接至其各自末端的第一和第二发夹衔接子的群体；由此制备片段的文库，其中一个末端通过核酸酶诱导的DNA双链断裂而产生。

6.如权利要求5所述的方法，该方法进一步包括：

使所述文库与尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和/或内切核酸酶VIII接触以在所述脱氧尿苷处使所述DNA产生缺口；以及

对携带第一和第二发夹衔接子的那些片段进行测序。