[发明专利]多次甲基化合物和其作为荧光标记物的用途

说明书

本发明涉及新的化合物以及它们作为荧光标记物的用途。所述化合物可用作核酸测序应用中的核苷酸的荧光标记物。

本公开内容涉及新的多次甲基化合物和其作为荧光标记物的用途。特别地，该化合物可用作在核酸测序应用中的核苷酸的荧光标记物。

背景技术

在本申请中引用若干出版物和专利文献，以便更充分地描述本公开内容所属的领域的状态。这些出版物和文献中的每个的公开内容通过引用并入本文。

利用荧光标记物的核酸的非放射性检测在分子生物学中是重要的技术。先前在重组DNA技术中采用的许多程序主要依赖于用例如³²P放射性地标记的核苷酸或多核苷酸的使用。放射性化合物允许灵敏检测核酸和其他感兴趣的分子。然而，在放射性同位素的使用中存在严重的限制，诸如其费用、有限的储存期以及更重要地安全考虑。排除对放射性标记物的需求提高安全性，同时减少与例如试剂处置相关的环境影响和成本。通过非限制性实例的方式，适合于非放射性荧光检测的方法包括自动DNA测序、杂交法、聚合酶链反应产物的实时检测和免疫测定。

对于许多应用，期望采用多重光谱可区别的荧光标记物以便实现多个空间上重叠的分析物的独立检测。在这类多重方法中，反应容器的数目可以减少，从而简化实验方案并且有利于产生应用特定的试剂盒。例如，在多色自动DNA测序中，多重荧光检测允许在单个电泳泳道中分析多个核苷酸碱基，从而使总处理能力(throughput)增加超过单色方法并且降低与泳道之间的电泳迁移率变化相关的不确定性。

然而，多重荧光检测可以是有问题的并且有限制荧光标记物的选择的许多重要因素。首先，可能难以发现发射光谱在给定的应用中被适当地光谱分辨的染料化合物。此外，当若干荧光染料被一起使用时，通过同时激发在可区别的光谱区中产生荧光信号可能是困难的，因为对此可以是可用的染料的吸收带通常被宽泛地分开，所以难以实现几乎相等的荧光激发效率(甚至对于两种染料)。许多激发方法使用高功率光源，如激光并且因此染料必须具有足够的光稳定性以经受这种激发。分子生物学方法中特别重要的最终考虑是荧光染料必须与使用的试剂化学成分诸如例如DNA合成溶剂和试剂、缓冲液、聚合酶和连接酶相容的程度。

随着测序技术提高，需要开发另外的荧光染料化合物、其核酸缀合物以及满足以上限制中的全部并且特别适合于高总处理能力的分子方法诸如固相测序以及类似方法的染料组。

具有改进的荧光性质诸如荧光带的荧光强度、形状和最大波长的荧光染料分子可以改进核酸测序的速度和精确度。当在基于水的生物缓冲液中并且在较高温度下进行测量时，强荧光信号是特别重要的，因为大部分染料的荧光强度在这类条件下是显著较低的。此外，染料被附接到其的碱基的性质也影响最大荧光、荧光强度和其他光谱染料性质。核碱基(mucleobase)和荧光染料之间的序列特定的相互作用可以通过荧光染料的特定设计来调整。荧光染料的结构的优化可以改进核苷酸并入的效率、降低测序误差的水平并且减少核酸测序中试剂的使用，并且因此降低核酸测序的成本。

本文描述改进的多次甲基构建体和其作为生物分子标记物、特别地作为用于在核酸测序中使用的核苷酸的标记物的用途。可以看到在使用新的荧光构建体可获得的标记的核苷酸并入的效率和测序读数的长度和精度上的具体改进。下述分子在使用高功率激发源的情况下特别有利。高功率激发可以导致一定程度的功率饱和，其中标记发射的光子数量随着激发功率的增加而停止线性化。功率饱和可以由与标记结构相关的分子猝灭效应引起，或者可以由具有比所需荧光寿命更长的标记引起，由此标记在发射光子之前花费比激发状态期望的更长的时间段。在并行使用多个不同标记的情况下，在其他标记持续变得更亮时使其中一个标记达到功率饱和(power saturation)，使标记的区分变得更加困难。本文描述的标记在达到比相应的现有技术标记化合物更高水平的功率饱和方面是特别有利的。

发明内容

根据本发明第一方面提供式(I)的化合物或其内消旋形式：

其中mCat+或mAn-为有机或无机带正电荷/带负电荷的抗衡离子，且