[发明专利]使用重构nif簇的氮固定

说明书

本发明涉及用于促进从大气氮固定氮的方法及相关产品。具有外源nif簇的内生细菌促进谷类植物的固定氮。

相关申请

本申请依据35U.S.C.§119(e)要求2015年10月5日提交的美国临时申请号62/237,426的权益，其通过引用整体并入本文。

背景技术

氮的可用性是限制作物生长和发育的主要因素之一，特别是在用于食品、饲料、纤维和燃料的植物生产的农业土壤中。过度使用合成肥料来满足人口增长的食品需求会造成环境威胁，因为这会导致有害的水华并破坏有益的土壤微生物群落[1]。另一方面，在许多肥料供应不足的发展中国家中，过度耕作损害了农业用地，使小农户遭受作物歉收[2]。

已经证实了人致病性细菌，例如肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、大肠杆菌(Escherichia coli)O157：H7对植物的成功内生定殖[3-5]。沙门氏菌可以将植物识别为合适的宿主，并在苜蓿和大麦的根组织中定殖[6，7]。

发明内容

在多个方面中，本发明涉及用于从大气氮提供固定氮的方法，其包括将具有外源nif簇的经修饰的细菌递送至谷类植物或者递送至其中谷类植物或种子正在生长或将要种植的土壤，其中经修饰的细菌提供固定氮。

在一些实施方案中，nif簇(cluster)是天然nif簇。在一些实施方案中，nif簇是重构(refactored)nif簇。

在另一些实施方案中，经修饰的细菌是γ-变形细菌(gamma-proteobacteria)。在一些实施方案中，经修饰的细菌是鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。

在一些实施方案中，鼠伤寒沙门氏菌菌株选自SL1344、LT2和DW01。

在另一些实施方案中，经修饰的细菌是大肠杆菌，任选地菌株H7：0157的大肠杆菌。

在另一些实施方案中，nif簇是克雷伯氏菌(Klebsiella)野生型nif簇、施氏假单胞菌(Pseudomonas Stutzi)nif簇或类芽孢杆菌(paenibacillus)簇。在一些实施方案中，nif簇是重构nif簇。

在一些实施方案中，谷类植物选自小麦、黑麦、大麦、黑小麦、燕麦、小米、高粱、苔麸(teff)、福尼奥米(fonio)、荞麦、藜麦、玉米和稻。

在一些实施方案中，本发明还包含编码植物生长刺激肽的外源基因。

在一些实施方案中，编码植物生长刺激肽的外源基因由3型分泌系统(type 3secretion system，T3SS)调节。

在一些实施方案中，植物生长刺激肽被直接递送至根或茎组织。

本发明的多个方面包括一种方法，其包括将具有使得能够发生植物内共生之外源基因的经修饰的非致病性细菌递送至谷类植物或者递送至其中谷类植物或种子正在生长或将要种植的土壤。

在一些实施方案中，非致病性细菌是大肠杆菌。

在一些实施方案中，所述基因编码用于分泌系统的效应器(effector)或器具(apparatus)。

在另一些实施方案中，用于分泌系统的器具是3型分泌系统(T3SS)。

本发明的多个方面包括组合物，其包含：农业上合适或相容的载体；以及存在于所述农业上合适或相容的载体之上或之中的具有外源nif簇的γ-变形细菌。

在一些实施方案中，变形细菌是鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌。