[发明专利]单细胞核酸序列分析

权利要求书

1.一种从多个单细胞制备cDNA文库的方法，所述方法包括以下步骤：

从每个单细胞中释放mRNA以提供多个单独的mRNA样品，其中每个单独的mRNA样品中的所述mRNA来自单细胞；

用第一链合成引物从每个单独的mRNA样品中的所述mRNA合成cDNA的第一链，其中所述第一链合成引物是寡聚dT引物和随机物引物的混合物，其中所述寡聚dT引物和所述随机物引物各自还包括第一扩增引物结合位点；

将标签并入所述cDNA以提供多个经标记的cDNA样品，其中每个经标记的cDNA样品中的所述cDNA与来自单细胞的mRNA是互补的，并且其中所述标签包括细胞特异性标识符序列和唯一性分子标识符（UMI）序列；

将所述经标记的cDNA样品池化；

扩增所述池化的cDNA样品以生成包括双链cDNA的cDNA文库；以及

进行标签化反应以同时切割所述cDNA文库的每个cDNA并且将衔接子序列并入所述双链cDNA的每个链中，由此生成多个经标记的cDNA片段，其中所述标签化反应包括使所述双链cDNA与包括未在所述第一链合成引物中发现的衔接子序列的转座酶混合物接触，并且其中所述转座酶混合物由具有相同的衔接子序列的转座体组成。

2.如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括扩增所述经标记的cDNA片段以生成扩增的经标记的cDNA片段。

3.根据权利要求2所述的方法，其中扩增包括向扩增产物的5’端添加额外的序列。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述额外的序列包括用于在固体支持物上扩增的引物结合序列。

5.如权利要求4所述的方法，所述方法进一步包括在固体支持物上扩增所扩增的经标记的cDNA片段。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述寡聚dT引物和/或所述随机物引物包含双链部分。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述寡聚dT引物和/或所述随机物引物与单链第一链合成引物相比，减少了串联副产物。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述寡聚dT引物和/或所述随机物引物包括能够形成发夹的区域。

9.如权利要求6所述的方法，其中所述寡聚dT引物和/或所述随机物引物包括RNA区域。

10.如权利要求6所述的方法，其中将所述寡聚dT引物和/或所述随机物引物杂交到互补的寡核苷酸，由此形成双链部分。