[发明专利]启动子变体

权利要求书

1.一种分离的和/或人工的pG1-x启动子，其由以下任一者组成的核苷酸序列组成：

a）SEQ ID 37-44，或SEQ ID 45-76中的任一者；

b）SEQ ID 77-80，或SEQ ID 81-112中的任一者；

c）SEQ ID 113-114，或SEQ ID 115-130中的任一者；

d）SEQ ID 131-132，或SEQ ID 133-148中的任一者；或

e）SEQ ID 185-186，或SEQ ID 187-202中的任一者。

2.根据权利要求1所述的pG1-x启动子，其由选自SEQ ID 37-44中的任一者或SEQ ID45-76中的任一者的核苷酸序列组成。

3.根据权利要求1或2所述的pG1-x启动子，其可操作地连接于编码相关蛋白质（POI）的核苷酸序列，该pG1-x启动子不与编码所述POI的核苷酸序列天然相关。

4.根据权利要求3所述的pG1-x启动子，其进一步包含编码能够实现所述POI分泌的信号肽的核苷酸序列，其中编码所述信号肽的核苷酸序列邻近编码所述POI的核苷酸序列的5'端。

5.一种表达构建体，其包含权利要求1-4中任一项所述的pG1-x启动子，其为自主复制载体或质粒，或整合于宿主细胞的染色体DNA中的载体或质粒。

6.一种重组宿主细胞，其包含如权利要求5所述的表达构建体，其为酵母或丝状真菌细胞。

7.根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其为酵母菌属或毕赤酵母属中的酵母细胞。

8.一种通过培养权利要求6所述的重组宿主细胞来产生POI的方法，其包含以下步骤：

a）在表达所述POI的条件下培养细胞，和

b）回收所述POI。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述培养包含：

a）使用抑制所述pG1-x启动子的基础碳源的第一步骤，其中所述基础碳源选自由葡萄糖、甘油、乙醇及其混合物和复合营养材料组成的组，接着

b）不使用或使用限制量的解除抑制所述pG1-x启动子的补充碳源，以诱导产生所述POI的第二步骤，其中所述补充碳源是己糖、二糖、乙醇或前述物质的混合物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第二步骤b）采用提供限制生长量的补充碳源的进料培养基，以使比生长率保持在0.001 h^-1至0.2 h^-1的范围内，或0.005 h^-1至0.15 h^-1范围内。

11.根据权利要求9所述的方法，其中培养是在生物反应器中进行，以分批阶段作为第一步骤开始，接着是分批进料阶段或连续培养阶段作为第二步骤，其中分批阶段进行20-36h，并且在分批进料阶段的培养进行15-80小时。

12.根据权利要求8所述的方法，其中所述重组宿主细胞为酵母菌属或毕赤酵母属或孔氏酵母属中的酵母细胞。

13.根据权利要求8所述的方法，其中所述重组宿主细胞为巴斯德毕赤酵母或巴斯德孔氏酵母中的酵母细胞。

14.根据权利要求8所述的方法，其中相比于细胞的天然pGAP启动子，所述POI以至少15%的转录率产生。

15.根据权利要求8所述的方法，其中所述POI为异源蛋白质，选自药用蛋白质。

16.根据权利要求8所述的方法，其中所述POI选自抗体或其片段、蛋白质抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白质结合物、结构蛋白、调节蛋白、疫苗蛋白、加工酶、生长因子、激素、细胞因子，或POI代谢物。