[发明专利]用于体外和体内表达的多核苷酸构建体

说明书

本发明涉及用于感兴趣的基因或感兴趣的基因的变体的体外和体内转录/翻译的多核苷酸构建体，连同包含此类构建体的微生物宿主细胞，以及用于在此类微生物宿主细胞中产生感兴趣的多肽的方法。

序列表的引用

本申请包含一个处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

技术领域

本发明涉及用于感兴趣的基因或感兴趣的基因的变体的体外和体内转录/翻译的多核苷酸构建体，连同包含此类构建体的微生物宿主细胞，以及用于在此类微生物宿主细胞中产生感兴趣的多肽的方法。本发明的构建体允许编码的所希望的一种或多种蛋白质的体外转录/翻译(IVTT)产生，连同将这些构建体直接转化到真菌宿主细胞中用于体内产生一种或多种分泌蛋白。

驱动体外转录的启动子正好位于编码感兴趣的成熟蛋白的基因上游的内含子中。内含子的上游是编码在体内从真菌启动子表达的分泌信号肽的多核苷酸。

背景技术

在具有分泌机制的微生物中成功体内生产感兴趣的分泌多肽通常取决于与多肽处于翻译融合的信号肽的表达。

但是，在一些情况下，优选体外表达感兴趣的多肽。这典型地是用无细胞的细胞提取物完成的，所述无细胞的细胞提取物包含DNA转录和翻译的所有先决条件。显然，在体外转录翻译(IVTT)系统中产生的感兴趣的多肽不需要信号肽，因为它将直接在无细胞培养基中产生。因此，如果正常地在体内产生了多肽的原或前-原形式，则将仅需要在IVTT系统中表达成熟多肽编码多核苷酸以产生成熟多肽。

如果信号肽被包括在体外表达构建体中，它将可能不会像在体内分泌过程中那样被切割掉，并且与成熟多肽相比，信号肽的存在会改变多肽的特征。因此，信号肽的存在对筛选体外表达的多肽也可能具有不希望的影响。

这当然意味着似乎需要单独的多核苷酸构建体来提供体内抑或体外的转录和翻译以产生感兴趣的多肽。

本发明基于以下事实：许多微生物(包括细菌和真菌宿主细胞)能够加工所谓的内含子。内含子是在最终信使RNA产物成熟期间通过RNA剪接去除的基因内的任何核苷酸序列。当蛋白质由包含内含子的基因编码时，RNA剪接作为在转录之后和翻译之前的RNA加工途径的一部分发生。

发明内容

本发明人成功地将一种人工内含子引入包含与编码信号肽的多核苷酸可操作连接的真菌启动子的多核苷酸构建体，所述信号肽与成熟脂肪酶处于翻译融合。

将人工内含子引入信号肽编码序列和成熟脂肪酶编码序列之间的多核苷酸构建体，这样使得其在真菌宿主细胞中的mRNA成熟过程中从转录的RNA中切除以产生编码信号肽的mRNA，所述信号肽与成熟脂肪酶处于正确的翻译融合。

当所得到的包含内含子的多核苷酸构建体转化到真菌宿主中时，产生并且分泌成熟脂肪酶。该结果表明，真菌宿主细胞已经转录了完整的RNA序列，然后在mRNA成熟过程中从RNA中去除内含子，并且将mRNA翻译成与脂肪酶处于正确融合的编码信号肽，而反过来所述脂肪酶又为细胞所分泌。

在将其整合到构建体中之前，将人工内含子工程化以包含已知在体外转录翻译(IVTT)系统中有活性的启动子，这样使得一旦内含子已经被引入到构建体，所述启动子将与成熟脂肪酶编码序列可操作地连接。

当所得到的包含内含子的多核苷酸构建体与IVTT系统混合时，直接在体外产生活性成熟脂肪酶。

通过这种方式，本发明人令人惊讶地提供了概念证据，即可以巧妙地将单个多核苷酸构建体放在一起以允许产生活性多肽，而不管它是直接在IVTT系统中产生还是由微生物宿主细胞体内分泌。

因此，在第一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸构建体，其以5'至3'的顺序包含以下元件：