[发明专利]DNA重组中的或与DNA重组相关的改进

权利要求书

1.一种构建基于疱疹病毒的疫苗的不基于PCR的方法，所述方法包括将异源遗传元件重组到靶病毒基因组中，所述异源遗传元件按照用于构建DNA重组片段的方法形成，所述DNA重组片段具有所述靶病毒基因组的基于重组的操作所需的与所述靶病毒基因组内的所需遗传操作位点同源的必需的侧接区，所述构建基于疱疹病毒的疫苗的不基于PCR的方法包括下述步骤：

A)鉴定所述靶病毒基因组中用于遗传元件的所需插入位点；

B)对存在于待靶向用于遗传操作的所述靶病毒基因组内所述位点上游的所选限制性内切核酸酶的内源的、本源的半位点进行定位，并由此确定上游同源区的5'范围，其中所述所选限制性内切核酸酶是稀有切点切割酶，其中所述稀有切点切割酶是至少8个核苷酸的切割酶；

C)对存在于待靶向用于遗传操作的所述靶病毒基因组内所述位点下游的同一所选稀有切点切割酶限制性内切核酸酶的内源的、本源的半位点进行定位，并由此确定下游同源区的3'范围；

D)合成侧接区基因盒(FRC)，其引起上游半位点和下游半位点的并置，从而导致形成侧接有所述上游同源区和下游同源区的所选限制性内切核酸酶的完整限制性位点，其中所述FRC通过不依赖于PCR的DNA合成技术来合成；

E)将所述FRC插入到包含用于操作所述靶病毒基因组的遗传元件的质粒载体中，并且通过使用所述所选限制性内切核酸酶在所述FRC内切开来将所述质粒载体线性化，在所述质粒载体上提供所述必需的侧接同源区，用于在所述所需插入位点处在所述靶病毒基因组内的重组；以及

F)在所述所需插入位点将所述遗传元件重组到所述靶病毒基因组中。

2.权利要求1的方法，其中所述FRC的上游同源区和下游同源区以与它们在所述靶病毒基因组中存在的顺序相反的顺序出现，使得在它们的接合处形成所述限制性位点。

3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述限制性内切核酸酶位点不存在于在所述靶病毒基因组的操作期间使用的所述侧接同源区或遗传元件内。

4.前述权利要求任一项的方法，其中所述上游同源区和下游同源区的长度为至少50个核苷酸。

5.前述权利要求任一项的方法，其中所述上游同源区和下游同源区的长度为至少500个核苷酸。

6.前述权利要求任一项的方法，其中所述遗传元件使用基于E/T的重组来插入。

7.前述权利要求任一项的方法，其中所述遗传元件使用基于CrispR/Cas9的重组来插入。

8.前述权利要求任一项的方法，其中所述靶病毒基因组选自人CMV(HCMV)、猿CMV(SCCMV)、恒河猴CMV(RhCMV)、黑猩猩CMV(CCMV)、鼠CMV(MCMV)、大猩猩CMV(GCMV)、牛疱疹病毒4(BoHV-4)、马疱疹病毒2(EHV-2)和鼬疱疹病毒1(MusHV-1)。