[发明专利]用于测定真菌菌株对于抗真菌剂的敏感性程度的方法

权利要求书

1.用于测定能够被钙荧光白（Calcofluor White）染色的真菌菌株的细胞群对于抗真菌剂的敏感性程度的方法，所述方法包括测定在所述抗真菌剂存在下在所述真菌菌株的细胞群的细胞壁的几丁质含量相对于在所述抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的细胞壁的几丁质含量而言的可能变化的步骤，

其中当所述真菌菌株具有针对所述抗真菌剂的敏感表型时，所述抗真菌剂能够引起壁胁迫，所述壁胁迫导致所述细胞群的细胞壁的几丁质的积累，以补偿所述抗真菌剂引起的损害，并且其中所述抗真菌剂选自没有多烯类且没有对于几丁质具有直接作用的抗真菌剂的抗真菌剂的组，

其中所述敏感性程度相应于敏感表型、抗性表型或中间表型，其中所述真菌为单细胞真菌，所述方法包括下列步骤：

a. 使所述真菌菌株的细胞与从0.0009至130 μg/ml变化的所述抗真菌剂的浓度梯度在30至35℃的温度下相接触少于或等于48小时的持续时间，从而获得所述真菌菌株的细胞与抗真菌剂的混合物的步骤；

b. 向前面获得的所述真菌菌株的细胞与抗真菌剂的混合物中添加荧光标记物钙荧光白，从而获得经钙荧光白标记的所述真菌菌株的细胞与抗真菌剂的混合物的步骤；

c. 通过高图像内容自动荧光显微术来对在前一个步骤中获得的混合物之中的经标记的所述真菌菌株的细胞的几丁质含量进行定量的步骤；

d. 测定在经钙荧光白标记的所述真菌菌株的细胞与抗真菌剂的混合物中，依照抗真菌剂浓度，在所述真菌菌株的细胞群中的几丁质含量相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的几丁质含量而言的可能变化的步骤；

并且在所述几丁质含量的可能变化为大于或等于20%的几丁质含量的增加的情况下，在上述步骤d之后接着为下列步骤

e. 对在经钙荧光白标记的所述真菌菌株的细胞与抗真菌剂的混合物中的细胞进行计数的步骤；然后

f. 测定依照抗真菌剂浓度，在所述真菌菌株的细胞群中的细胞数目相对于在抗真菌剂不存在下在所述真菌菌株的细胞群中的细胞数目而言的可能变化的步骤；

当上述步骤d的所述几丁质含量的变化为小于10%的几丁质含量的增加或者小于20%的几丁质含量的减少时，推断所述真菌菌株具有抗性表型；

当上述步骤d的所述几丁质含量的变化为10%至小于20%的值的增加时，推断所述真菌菌株具有中间表型；

当上述步骤d的所述几丁质含量的变化为大于或等于20%的值的增加并且上述步骤f的所述细胞数目的变化为小于0.3 log的减少时，推断所述真菌菌株具有中间表型；和

当上述步骤d的所述几丁质含量的变化为大于或等于20%的值的增加并且所述细胞数目的变化为至少0.3 log的减少时，推断所述真菌菌株具有敏感表型。

2.根据权利要求1的方法，其中所述抗真菌剂选自包括下列各项或由下列各项组成的组：唑类抗真菌剂或其他抑制麦角固醇合成的分子。

3.根据权利要求1或2的方法，其中在步骤a中，所述接触步骤是6.5小时至24小时的持续时间。

4.根据权利要求1或2的用于测定真菌菌株的细胞群对于抗真菌剂的敏感性程度的方法，所述真菌为单细胞真菌，所述方法包括测定在抗真菌剂存在下所述真菌菌株的细胞群的几丁质含量相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的几丁质含量而言的可能变化的步骤，和测定在抗真菌剂存在下在所述真菌菌株的所述细胞群中的细胞数目的可能变化的步骤，所述细胞数目的变化相对于在抗真菌剂不存在下所述真菌菌株的细胞群的细胞数目而言来进行测定。