[发明专利]分析病毒来源治疗剂的方法

权利要求书

1.一种测定脊髓灰质炎病毒来源治疗剂中脊髓灰质炎病毒序列变体的方法，包括：

从主病毒库或工作细胞库提取RNA，其中主病毒库或工作细胞库包含含有脊髓灰质炎病毒来源治疗剂的宿主细胞；

将提取的RNA与2U/μl的4U脱氧核糖核酸酶在37℃下，于消化宿主细胞基因组DNA和宿主细胞线粒体DNA、但不消化病毒RNA分子的条件下接触20-40分钟，由此产生富集的病毒RNA；

失活脱氧核糖核酸酶；

从富集的病毒RNA产生双链cDNA，使用寡聚(dT)_x引物从而产生病毒双链cDNA；

扩增病毒双链cDNA；

定量病毒双链cDNA；

从500pg到1ng病毒双链cDNA产生测序文库，其中通过随机片段化双链cDNA产生cDNA片段，将5'衔接子和3'衔接子连接到cDNA片段以产生连接有衔接子的cDNA片段，并扩增连接有衔接子的cDNA片段从而产生测序文库；

使用结合于表面的或颗粒结合并与5'衔接子和3'衔接子互补的寡核苷酸，克隆扩增所述测序文库以产生克隆扩增的测序文库；

使用平行的单端或双端测序，对克隆扩增的测序文库进行测序，以产生包含多个序列读序的原始序列数据集；

将所述多个序列读序与脊髓灰质炎病毒来源治疗剂的参照脊髓灰质炎序列进行比对，以产生包含多个匹配的序列读序的匹配序列；和

从所述匹配序列确定脊髓灰质炎病毒序列变体。

2.一种测定脊髓灰质炎病毒来源治疗剂中脊髓灰质炎病毒序列变体的方法，其特征在于，包括：

将脊髓灰质炎病毒来源治疗剂引入Vero宿主细胞；

在允许脊髓灰质炎病毒来源治疗剂增殖的条件下，培养Vero宿主细胞；

从Vero宿主细胞中提取脊髓灰质炎RNA分子；

在消化Vero宿主细胞基因组DNA和Vero宿主细胞线粒体DNA、但不消化脊髓灰质炎RNA的条件下，将提取的脊髓灰质炎RNA与2U/μl的4U DNA酶在37℃接触20-40分钟，从而产生丰富的脊髓灰质炎RNA；

失活DNA酶；

使用寡聚(dT)_x引物逆转录所提取的病毒性脊髓灰质炎RNA，从而产生脊髓灰质炎双链cDNA；

扩增脊髓灰质炎双链cDNA；

定量脊髓灰质炎双链cDNA；

从500pg至1ng的脊髓灰质炎双链cDNA产生测序文库，其中通过随机片段化脊髓灰质炎双链cDNA以产生脊髓灰质炎cDNA片段，将5'衔接子和3'衔接子连接到脊髓灰质炎cDNA片段从而产生连接有衔接子的脊髓灰质炎cDNA片段，并扩增连接有衔接子的脊髓灰质炎cDNA片段从而产生测序文库；

使用结合于表面的或颗粒结合且与5'衔接子和3'衔接子互补的寡核苷酸，克隆扩增测序文库以产生克隆扩增的测序文库；

使用平行的单端或双端测序，对克隆扩增的测序文库进行测序，以产生包含多个序列读序的原始序列数据集；

将所述多个序列读序与脊髓灰质炎病毒来源治疗剂的参照脊髓灰质炎序列进行比对，以产生包含多个匹配的序列读序的匹配序列；和

从所述匹配序列确定脊髓灰质炎病毒序列变体。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法进一步包括确定所述多个匹配的序列读序的平均读取长度、匹配读序的百分比、覆盖度、SNP或其组合。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中，当产生未匹配的序列读序时，将所述未匹配的序列读序添加到未匹配的序列读序池以供识别。

5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述方法进一步包括：报告所述脊髓灰质炎病毒来源治疗剂对所述脊髓灰质炎病毒来源治疗剂参考序列的共有同源性、每个位置的每种碱基覆盖度、大于0.1％读序的异源碱基、或其组合。

6.如权利要求1或3所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌细胞或Vero细胞。

7.如权利要求1至6中任一所述的方法，其中使所述提取的核酸分子与DNA酶接触包括：在37℃下将所述提取的核酸分子与所述DNA酶温育30分钟。