[发明专利]深内含子突变的基因编辑

权利要求书

1.组合物在制备用于治疗与个体核酸中的突变相关的莱伯先天性黑朦的药物中的用途，其中所述组合物包含：

a) 编码工程改造的、非天然存在的成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)—CRISPR相关(Cas) (CRISPR-Cas)系统的核酸，所述系统包含第一引导RNA和第二引导RNA，其中所述第一引导RNA和所述第二引导RNA与靶DNA序列的相反DNA链杂交，其中所述靶DNA包含中心体蛋白290 kDa(CEP290)基因中的深内含子突变和所述深内含子突变侧翼的序列，其中第一引导和第二引导与侧翼序列的相反位点杂交；和

b) Cas表达盒，其包含

i) 编码Cas蛋白的核苷酸序列，和

ii) 第一引导RNA靶位点，其中所述第一引导RNA或所述第二引导RNA与所述第一引导RNA靶位点杂交；

其中所述Cas蛋白由所述Cas表达盒表达；

其中所述Cas蛋白切割在所述突变侧翼的靶DNA序列，从而切除包含所述突变的靶DNA部分；并且

其中所述Cas蛋白在所述第一引导RNA靶位点处切割所述Cas表达盒，从而与切割所述Cas表达盒之前的所述Cas蛋白的表达相比降低了所述Cas蛋白的表达。

2.权利要求1的用途，其中所述Cas表达盒进一步包含：

iii) 第二引导RNA靶位点，其中所述第一引导RNA或所述第二引导RNA与所述第二引导RNA靶位点杂交；

其中所述Cas蛋白在所述第一和所述第二引导RNA靶位点处切割所述Cas表达盒，从而与切割所述Cas表达盒之前的所述Cas蛋白的表达相比降低了所述Cas蛋白的表达。

3.权利要求2的用途，其中所述第一引导RNA与所述第一引导RNA靶位点和所述第二引导RNA靶位点杂交。

4.权利要求2的用途，其中所述第二引导RNA与所述第一引导RNA靶位点和所述第二引导RNA靶位点杂交。

5.权利要求2的用途，其中所述第一引导RNA与所述第一引导RNA靶位点杂交，并且所述第二引导RNA与所述第二引导RNA靶位点杂交。

6.权利要求1-5中任一项的用途，其中Cas表达盒进一步包含与编码所述Cas蛋白的核苷酸序列可操作连接的多腺苷酸化(polyA)序列。

7.权利要求6的用途，其中所述polyA序列是SV40 polyA序列。

8.权利要求6或7的用途，其中通过所述Cas蛋白切割所述第一或所述第二引导RNA靶位点中断了编码所述Cas蛋白的核苷酸序列与所述polyA序列之间的可操作连接。

9.权利要求6-8中任一项的用途，其中所述第一或所述第二引导RNA靶位点位于编码所述Cas蛋白的核苷酸序列与所述polyA序列之间。

10.权利要求1-9中任一项的用途，其中编码所述Cas蛋白的核苷酸序列与编码一个或多个核定位信号(NLS)的核苷酸序列可操作连接，使得从所述Cas表达盒表达的所述Cas蛋白与所述一个或多个NLS框内融合。

11.权利要求10的用途，其中编码所述一个或多个NLS的核苷酸序列位于编码所述Cas蛋白的核苷酸序列与多腺苷酸化(polyA)序列之间。

12.权利要求11的用途，其中所述第一或所述第二引导RNA靶位点位于编码所述一个或多个NLS的核苷酸序列与所述polyA序列之间。

13.权利要求10-12中任一项的用途，其中所述一个或多个NLS包括SV40大T抗原中的C端序列。