[发明专利]用于检测Htert基因的启动子中的突变的方法，序列，组合物和试剂盒

说明书

本发明涉及一种检测Htert基因启动子中c.‑124C>T和c.‑146C>T突变的方法。所述方法使用了反应组合物，其包含扩增引物和用于基因分型的探针。本发明的另一方面涉及引物和探针，其用于以表示为SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.6的序列进行前述方法，其表现出对于这些突变的高特异性，以及包含这些引物和探针的组合物。本发明进一步涉及包含上述组合物的试剂盒，其用于通过进行本发明的方法来检测Htert基因启动子中的c.‑124C>T突变和c.‑146C>T突变。本发明的方法、基因序列、组合物和试剂盒可以有利地用于检测生物样品中的痕量的c.‑124C>T突变和c.‑146C>T突变，这是由于其对于这样的突变的高灵敏性和特异性。本发明因此可以用于与这类突变有关的疾病的早期检测、鉴别、复发检测或者预测和监测，例如膀胱癌、甲状腺癌、鳞状上皮细胞癌、基细胞癌、黑素瘤、神经胶质瘤和肝细胞癌等，并且最终提供用于限定适当的治疗的基础。因此，本发明涉及医学、药学、分子生物学、生物化学和人类遗传学的技术领域。

技术领域

本发明涉及一种超灵敏检测Htert基因启动子中的c.-124C>T和c.-146C>T突变的方法，包含用于扩增的引物和用于基因分型的探针的反应组合物，被称作SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6的序列(其被设计来显示对于这些突变的高特异性)，以及包含用于进行所述方法的这类组合物的试剂盒。

本发明可以有利地用于检测生物样品和体外存在的痕量的这类c.-124C>T和c.-146C>T突变，这归因于所述方法的高灵敏性和所产生的基因序列的特异性，并且由此允许与那些突变相关的疾病的早期检测，复发鉴别或者预测和监测，例如膀胱癌、甲状腺癌、鳞状上皮细胞癌、基细胞癌、皮肤癌、中枢神经系统癌和肝细胞癌等，并且最后提供适当的治疗设置的基础。

因此，本发明落入医学，药学，分子生物学，生物化学和人类相关遗传学的技术领域。

背景技术

在DNA复制(其先于有丝分裂)过程中发生的体细胞突变是某些人类疾病的源头，特别是某些类型的癌症的源头。在高百分比(大约75-80％)的肿瘤细胞系中观察到存在着酶端粒末端转移酶。最近，本申请人已经鉴别了编码这种酶的端粒末端转移酶基因——TERT基因——的启动子中的突变，特别是在位置c.-124C>T和c.-146C>T(从初始ATG起算)处的突变。这些突变与几个恶性肿瘤有关，例如中枢神经系统癌(43-51％)，膀胱癌(59-66％)，肝细胞癌(59％)，甲状腺癌(10％)，皮肤癌(黑素瘤29％-73％，73％基细胞癌(BCC)和鳞状上皮细胞癌(SCC)45％)和胃肠道间质肿瘤(GISTs)(4％)[1-7]。

端粒末端转移酶启动子突变以相对较高的频率存在于某些癌症中的事实使得它们是用于早期检测，诊断，预后，复发检测或者预测/监测肿瘤的治疗响应的潜在生物标记物，例如中枢神经系统肿瘤，膀胱癌，肝细胞癌，甲状腺癌和皮肤癌等。例如在膀胱癌中，在端粒末端转移酶基因的位置c.-124C>T和c.-146C>T(从ATG起算)处的体细胞突变是普遍的，其达到了85％，并且与在成纤维细胞生长受体3(FGFR3)基因中的突变R248C和S249C[9]一起为用于膀胱癌的最可靠的生物标记物。

但是，对于体外使用的生物样品液体(例如尿，血浆，脑脊液，抽吸细胞学(aspiration cytology)等)，在端粒末端转移酶基因的位置c.-124C>T和c.-146C>T(从ATG起算)的突变检测方法必须具有高的分析灵敏性，来检测痕量的突变等位基因，甚至当它们在样品中被更丰富的“野生型”等位基因“稀释”时更是如此。