[发明专利]用于优化异源多聚体蛋白质复合物的装配和生产的方法

说明书

提供了通过调节装配蛋白质复合物所需要的各组分的表达水平来改进所述复合物的表达的方法。这些方法有效地限制优势链的表达，因此平衡它们的相对丰度。本文提供的方法导致在瞬时表达系统中以及在稳定转染的哺乳动物细胞中生产力和最终的双特异性收率显著增加。

相关申请

本申请要求2015年3月31日提交的美国临时申请号62/141009的权益，其各自的内容通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

提供了通过调节装配蛋白质复合物所需的各组分的表达水平来改进所述复合物的表达的方法。这些方法有效地限制优势链的表达，因此平衡它们的相对丰度。本文提供的方法导致在瞬时表达系统中以及在稳定转染的哺乳动物细胞中生产力和最终的双特异性收率显著增加。

发明背景

在细菌、酵母、昆虫、植物或哺乳动物细胞中的重组表达对于生产用于研究以及治疗应用的蛋白质而言是重要的。最近，通过优化多个参数例如培养基组成、发酵参数以及用于驱动编码目的重组蛋白质的基因的表达的构建体的优化，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的重组蛋白质表达收率已显著提高。

一些蛋白质由若干多肽构成，这些多肽可缔合成可共价或非共价连接的复合物。抗体是这类蛋白质的实例，因为它们由通过二硫键连接的四个多肽构成(即，两条重链和两条轻链)。由于它们的商业和治疗重要性，抗体在CHO细胞中的表达已成为强烈努力优化的主题，目的为使构成抗体的两种链的表达最大化。然而，在抗体之间可观察到大的差异，因为表达水平可变化达200倍。

之前的优化方法目的在于增加多肽的表达水平，以实现更高的生产收率。在由多种多肽构成的蛋白质复合物的情况下，不平衡的表达可限制需要的分子的装配，促进不需要的产物的生产和限制总体生产收率。因此，对改进蛋白质复合物的表达的方法存在需要。

发明简述

本公开内容的方法通过调节装配蛋白质复合物所需的各组分的表达水平来改进所述复合物的表达。与之前描述的方法相反，减少蛋白质复合物中一种或数种多肽的表达提高蛋白质复合物的装配和收率。该方法特别适合于优化通常依赖于多种多肽的共表达的双特异性抗体的表达和收率。一种组分的不平衡表达(太高或太低)可导致需要的终产物显著降低和不需要的副产物的生产增加。这种限制可影响IgG-样双特异性形式以及基于抗体片段的形式二者。

该方法可特别适合于优化称为κλ-体的双特异性抗体的表达(Fischer等,Exploiting light chains for the scalable generation and platform purificationof native human bispecific IgG. Nat. Comms, 6: 6113 (2015))。该技术产生全人双特异性抗体(BsAb)，其由共同的重链和两条不同的轻链(一条κ和一条λ)构成(参见例如WO2012/023053)。包括这三种链的专有三顺反子载体被引入哺乳动物细胞，以产生除了两种单特异性抗体IgGκ和IgGλ之外的双特异性抗体(κλ-体)，其包含一条κ和一条λ链。

原则上，如果两种轻链以相同的速率表达和以类似的方式装配，那么这三种分子的比率应该是25% IgGκ、25% IgGλ和50% IgGκλ。然而，有时观察到两种链的不平衡的表达水平，导致双特异性收率降低。一个解决方案可以是增加较低表达的链的表达以恢复平衡。然而，该方法已经失败(如在本文提供的有效实施例中所示)。

相比之下，本公开内容的方法有效地限制优势链的表达，因此平衡它们的相对丰度。本文公开的方法导致在瞬时表达系统中以及在稳定转染的CHO细胞中生产力和最终的双特异性收率显著增加。因此，减少一种或数种多肽的表达可导致生产力总体增加。尽管本文提供的实施例使用κλ-体，但本文公开的方法可适用于其它双特异性抗体形式和由数种不同的多肽构成的任何其它蛋白质复合物。