[发明专利]改进的甲基化DNA检测

说明书

本发明基于通过以下的敏感且特异性的甲基化检测的发现：a)在通过将DNA转化试剂(例如，亚硫酸氢盐试剂)直接与含有核酸的样品一起温育而控制转化前的过量DNA降解，而不需要从所述样品预先纯化核酸且不需要在98℃的升高的温度下预先使核酸变性，和b)通过控制亚硫酸氢盐处理的样品在自动化系统内的提取膜上的泵送流动速率而优化亚硫酸氢盐去除。

技术领域

本申请涉及在自动化系统上检测核酸中的甲基化胞嘧啶的方法，以及所述系统和所述系统的卡式芯片(cartridge)用于检测和分析甲基化的核酸的用途。

背景技术

DNA甲基化是基因表达的表观遗传控制的机制之一。基因组DNA的甲基化状态的改变可以导致基因沉默。这种控制对于广泛的生物过程，包括通过例如关键生长调节剂如肿瘤抑制基因的转录沉默的细胞增殖，是重要的。DNA甲基化在调控基因表达的生物学意义及其在癌症中的作用越来越受到重视。

通过在胞嘧啶环的5'碳上共价加成甲基基团而将基因组DNA中的胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶，发生DNA甲基化。在哺乳动物DNA中，5-甲基胞嘧啶存在于大约4％的基因组DNA中，主要是富含胞嘧啶-鸟苷二核苷酸(CpG)的序列链上，所谓的“CpG岛”。基因组DNA中的一些CpG岛的超甲基化可以导致基因沉默，而低甲基化可以导致转录和基因表达。

对开发分子技术以分析CpG岛上的基因组DNA甲基化存在很大的兴趣。使用亚硫酸氢钠的DNA处理将胞嘧啶转化成尿嘧啶，同时保持5-甲基胞嘧啶完好的发现，已经对在区域和整体水平上研究基因组DNA甲基化的许多策略打开了大门(Frommer et al.)。通常，该方法涉及以下基本步骤：

1)从样品中纯化DNA，

2)DNA变性(在98℃下至少10分钟的DNA加热步骤)，

3)通过在升高的温度下用亚硫酸氢盐(转化试剂)温育DNA(至少54℃下1小时或更久)来用磺化脱氨基以产生转化的DNA，

4)通常在具有DNA结合介质(树脂或膜)的柱上，通过纯化除去亚硫酸氢盐，

5)脱磺化，即加入脱磺化缓冲液，然后在室温下温育通常20min，并通过离心除去脱磺化缓冲液，

6)一个或多个洗涤步骤，

7)洗脱DNA，通常通过加入洗脱缓冲液和离心步骤(在柱上)。

DNA甲基化检测目前主要应用于疾病诊断方法。具体地，这些方法可以应用于癌症诊断。

为了有效和高效制备用于各种下游分析的转化DNA，理想的DNA亚硫酸氢盐改性方法应该是：(1)高度精确的，以允许胞嘧啶完全转化成尿嘧啶，而不会将甲基胞嘧啶脱氨基为胸腺嘧啶；(2)足够保守的，以最小化DNA降解，和(3)尽可能快的，使得亚硫酸氢盐过程可以尽可能短。不幸的是，目前的大多数DNA转化方法由于手动处理和亚硫酸氢盐温育时间(其为成功的亚硫酸氢盐转化的关键考虑因素)的控制不足而显示出很大的变化。

许多目前可商购的试剂盒的进一步限制是它们通常在转化后和进一步下游分析样品可以发生之前通常包括亚硫酸氢盐去除步骤。这不可避免地引入额外的手动处理步骤，如添加几种缓冲液，包括洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，进行额外的离心步骤，使样品经过低洗脱旋转柱等。另外，考虑到许多当前可用的试剂盒需要预先准备患者样品，例如，在加热步骤中纯化DNA和/或使DNA变性，现有的DNA亚硫酸氢盐改性方法涉及大量的手动处理，这使得它们难以自动化并且耗时。

所描述的因素限制了最佳的DNA亚硫酸氢盐转化，并进一步使其成为由受训练的实验室人员实施的耗时过程。因此，看上去存在对于对所提出的问题提供解决方案的甲基化DNA的检测系统的需要。

发明内容