[发明专利]用于检测靶核酸的高灵敏度方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种靶核酸的高灵敏度检测方法，其包括组合至少一种选择性抑制非靶核酸的核酸扩增的寡核苷酸和具有错配核酸内切酶活性的多肽。

背景技术

已知有遗传性或后天性疾病与包括碱基置换、缺失和插入的基因突变有关。在这些突变中，某些突变与疾病直接相关和某些突变与疾病的风险和/或预后有关。在这些疾病中，对于随着疾病的进展而野生型基因变为突变型基因或具有突变型基因的细胞增加的疾病，检测突变型基因的存在是重要的。伴有基因突变的后天性疾病的实例和与疾病有关的基因突变的实例包括：肺癌和EGFR基因突变或K-ras基因突变；肺鳞状细胞癌和DDR2基因突变；结肠直肠癌和K-ras基因突变、PIK3CA基因突变或B-raf基因突变；及胃癌和Kit基因突变或PDGFR基因突变。

也存在与上述的案例相反的情况。例如，在伴有基因突变的后天性疾病治疗过程中，监测到突变型基因减少和野生型基因增加。作为一个实例，提到微小残留病变的检测。

作为一种分析基因突变的方法，限制性片段长度多态性方法(RFLP法)已被常规使用。然而，RFLP法需要繁琐操作和时间长。另外，依单核苷酸多态性(SNP)位点邻近的核苷酸序列而定，RFLP法可能不常应用。因此，已有人指出RFLP法对临床实验室使用存在许多问题。近年来，已开发了各种更简单和通用的方法，包括侵入物(Invader)法、TaqMan PCR法、单碱基延伸法、焦磷酸测序(pyrosequencing)法和核酸外切酶循环试验法。然而，在使用常规PCR的情况下，当与野生型基因混合的少量突变型基因小于野生型基因量的5%时，在突变型基因的靶核酸达到可检出量之前扩增反应到达平台期，并且因此靶核酸不能完全检测。

因此，PCR方法对检测作为靶核酸的突变型基因是一种非常有用的工具。然而，在PCR方法中，随着扩增产物的浓度增加，扩增产物的退火与引物退火之间竞争越来越激烈，并且最后引物不能退火且反应达到平台期。结果，含有SNP或短缺失或插入的靶核酸的扩增片段与大量过量存在的非靶核酸的扩增片段一同退火。因此，当扩增反应到达平台期时，靶核酸的扩增片段的丰度比降至低于反应开始之前的丰度比。因此，为了检测相同区域的少量SNP或缺失或插入，有必要自突变型基因特异性地扩增核酸，同时抑制野生型基因的核酸扩增。

作为选择性扩增突变型基因的核酸同时抑制野生型基因的核酸扩增的方法的实例，富集PCR法(非专利文献1)和限制性核酸内切酶介导的选择性PCR方法(非专利文献2和3及专利文献1)已被报道。在这些方法中，在含有目标基因的突变位点核苷酸序列的引物中引入限制性内切酶的识别/切割位点，并从而选择性扩增突变型基因，同时抑制野生型基因的扩增。然而，这些方法需要选择能够识别和切割待分析的目标基因中的突变位点的限制性内切酶，并且另外，由限制性内切酶识别和切割的基因必须为野生型基因。另外，在PCR循环期间，限制性内切酶不得被灭活。存在的问题是只有有限的限制性内切酶满足这些要求，并且方法适用的对象野生型基因和突变型基因受限。

作为另一种用于扩增野生型基因中核酸和突变型基因中核酸的方法，已建议用3’修饰的寡核苷酸进行突变体富集(MEMO)的方法(非专利文献4和专利文献2)。这种方法使用含有目标基因的突变位点的3’末端封端引物。3’末端封端引物的特征为与野生型基因100%匹配，而与突变型基因错配。通过使用3’末端封端引物，在野生型基因的核酸扩增中，用于扩增的引物退火和延伸受到抑制。另一方面，在突变型基因的核酸扩增中，由于突变型基因与3’末端封端引物之间错配而导致不稳定，因而不能抑制用于扩增的引物退火和延伸。结果，突变型基因的核酸扩增优先。方法中的检测通过解链曲线分析或测序实施。然而，该方法须使3’末端封端引物杂交，以致仅抑制野生型基因的引物延伸反应，并且要求在核酸扩增反应期间严格控制温度。另外，保持在初始样品中大量存在的野生型基因的初始量，并且不能减少野生型基因的核酸的意外扩增。

最近几年，已经报道了包括使用耐热错配核酸内切酶(专利文献3)的突变检测方法。然而，为抑制野生型基因的核酸扩增并选择性扩增突变型基因以便仅正确检测突变型基因的存在，这些方法仍存在问题。

文献列表

专利文献

专利文献1：WO 1996/32500

专利文献2：US 2013/0149695 A

专利文献3：WO 2014/142261

非专利文献

非专利文献1：Leukemia, 第5卷 第2期, 第160-161页, 1991.