[发明专利]使用环化的配对文库和鸟枪测序检测基因组变异的方法

说明书

相关申请的参考

该国际专利申请要求2015年4月2日提交的美国临时专利 申请第62/142,088号的申请日的权益，其全部内容通过引用并入本文。

背景技术

已知遗传变异发生在人群中从单核苷酸置换到大规模结构 变异的所有水平上。许多基因组变异代表了多样的人类性状的正常表 型变化，而一些变异与疾病有关。然而，疾病相关遗传变异的检测和 表征在技术上是具有挑战性的，特别是在包括自闭症在内的复杂疾病 中。

自闭症谱系障碍(ASD)是神经发育疾病，其特征是交流和社 会互动中的困难或缺陷。根据CDC，ASD诊断率自2000年以来急剧 上升，从大约150名儿童中1名增加到2014年的68名儿童中1名。 诊断标准涵盖广泛的症状，包括行为和损伤的严重程度，且患者常常 被诊断为患有其他神经精神障碍，如癫痫。直到最近，几乎所有ASD 病例的基础疾病途径是未知的。

最近的研究表明，ASD和相关疾病可能与以大的染色体改 变或单核苷酸变体(SNV)形式的新生的或罕见的遗传变异相关(Carter 和Scherer,Clin.Gen.,83:399-407,2013；Jiang et al.,Am.J.Hum.Gen., 93:249-263,2013；Pinto et al.,Am.J.Hum.Gen.94:677-694,2014； Rosti et al.,Dev.Med.and Child Neurol.,56:12-18,2014)。目前的诊断 工具包括阵列比较基因组杂交(aCGH)，其鉴定患者DNA中的拷贝数 变异(CNV)-染色体缺失和重复。最近，已经开发了鉴定与ASD相关 的约50种不同基因中的特定单核苷酸变异(SNV)和小插入缺失(indels) 的测定法(基因小组测试)。

然而，aCGH和基因小组测试必须使用不同的且不相容的 技术单独地运行(例如，DNA杂交对DNA测序)。此外，现有的基因 小组测试受到某些基因与感兴趣的疾病或病症(例如ASD)之间的已知 或潜在的联系的限制，并且不一定代表能够鉴定具有与感兴趣的疾病 或病症的已知或仍未知的联系的所有相关基因中的这些小突变的全 面且无偏的方法。

例如，最近发现患有ASD和巨头畸形的儿童可能带有 PTEN基因中的突变。PTEN中的突变也导致许多类型的癌症(包括甲 状腺、乳腺和皮肤)的风险急剧增加。因此，鉴定为携带PTEN中的 突变的儿童需要在儿童早期开始进行癌症筛查，因为肿瘤的迅速鉴定 对于改善预后至关重要。其他自闭症风险基因(如POLG)中的突变会 影响来自药物治疗(如丙戊酸)的毒性的风险。事实上，鉴定处于危 险中的那些人对于尽量减少这个群体中的不良反应至关重要。

此外，更多的基因最近已经成为与ASD相关，但尚未并入 当前提供的基因测序组中。例如，刚刚显示，KCNQ2中的突变(Jiang et al.，2013)与自闭症相关，且可能最终成为未来个性化治疗的一个 靶点，这表明Kv7通道开放剂最终可能成为自闭症的未来个性化治疗 的一个靶点(Rundfeldt和Netzer,2000)。然而，该基因尚未在目前可 得的任何基因小组测试中。

高通量DNA测序技术的最新进展可适用于ASD和其他患 者的全基因组分析。可能的策略是进行整个基因组鸟枪或外显子组测 序以鉴定所有SNP，以及进行长片段配对末端标签测序以鉴定患者的 基因组的所有SV。这些方法的组合将能够识别所有的遗传变异。然 而，它将涉及多个实验和分析流程，这将是消耗时间和资源的。

一种理想的策略将是从一个患者样品构建单一DNA文库， 并进行单次测序操作以在一个数据分析流程中生成基因SNP识别 (call)(目前由基因小组测序完成)、CNV(目前通过aCGH完成)和SV(目 前通过大片段PET测序完成)鉴定的必要数据。

因此，将通过aCGH或测序鉴定CNV的能力与有限的、靶向的 测序平台的能力结合成更有效(时间方面和成本方面)和全面的单一 分析的新技术可能成为用于ASD分子诊断的新标准。

发明内容

本文所述的本发明的方法和试剂提供了一种全基因组分析 技术，其使得能够在单次分析中检测宿主基因组(包括但不限于人 ASD患者)中的广泛的基因组变异。