[发明专利]超纯化DsbA和DsbC及其制备和使用方法

权利要求书

1.一种从包含DsbA多肽的细胞裂解物中纯化DsbA多肽的方法，所述方法包括：

a)向包含DsbA多肽的细胞裂解物中加入聚乙烯亚胺(PEI)至约0.01％至约1.0％的终浓度，

b)通过离心澄清细胞裂解物，

c)将包含DsbA多肽的澄清的细胞裂解物施用于阴离子交换色谱材料，

d)从阴离子交换色谱材料洗脱DsbA多肽以产生包含DsbA多肽的阴离子交换洗脱物，

e)将包含DsbA多肽的阴离子交换洗脱物施用于阳离子交换色谱材料，

f)从阳离子交换色谱材料洗脱DsbA多肽以产生包含纯化的DsbA多肽的阳离子交换洗脱物。

2.根据权利要求1的方法，其中包含DsbA多肽的细胞裂解物在阴离子交换色谱之前保持在PEI中至少约16小时。

3.根据权利要求1或2的方法，其中裂解物中的PEI的最终浓度为约0.1％。

4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中包含DsbA多肽和PEI的裂解物的pH为约7.0。

5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中阴离子交换色谱材料是强阴离子交换剂。

6.根据权利要求5的方法，其中强阴离子交换剂包含季胺。

7.根据权利要求5或6的方法，其中季胺与交联的琼脂糖连接。

8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中DsbA是使用盐梯度从阴离子色谱材料中洗脱。

9.根据权利要求8的方法，其中盐梯度是不连续梯度。

10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中澄清的裂解物包含10mM MOPS，pH 7.1。

11.根据权利要求10的方法，其中DsbA是利用以下步骤从阴离子交换色谱材料中洗脱：

约15％的约25mM Tris和约250mM NaCl，在约pH9.2下，约4个柱体积，

约20％的约25mM Tris和约250mM NaCl，约pH9.2，约4个柱体积，

约25％的约25mM Tris和约250mM NaCl，约pH 9.2直至DsbA从柱中洗脱出来。

12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中将步骤b)的包含DsbA多肽的澄清裂解物在阴离子交换色谱之前通过0.22μm过滤器。

13.根据权利要求1-12中任一项的方法，其中将步骤b)的包含DsbA多肽的澄清裂解物在阴离子交换色谱之前调节至pH约9.0。

14.根据权利要求1至13中任一项的方法，其中阴离子交换洗脱物以级分收集。

15.根据权利要求13的方法，其中在阳离子交换色谱之前通过尺寸排阻色谱分析级分。

16.根据权利要求15的方法，其中选择包含至少约55％DsbA的级分用于进一步纯化。

17.根据权利要求1-16中任一项的方法，其中阳离子交换材料包含磺丙基部分。

18.根据权利要求17的方法，其中磺丙基部分连接到交联的聚(苯乙烯-二乙烯基苯)基质或其等同物。

19.根据权利要求1-18中任一项的方法，其中将步骤d)的阴离子交换洗脱物在阳离子交换色谱之前调节至pH约5.0。

20.根据权利要求1-19中任一项的方法，其中DsbA是使用盐梯度从阳离子色谱材料中洗脱。

21.根据权利要求20的方法，其中阳离子色谱材料用5个柱体积的12.5mM MES洗涤。

22.根据权利要求20或21的方法，其中盐梯度是15个柱体积以上的约0％至约60％的12.5mM MES和1M NaCl的梯度。

23.根据权利要求20-22中任一项的方法，其中阳离子交换洗脱物以级分收集。

24.根据权利要求23的方法，其中通过尺寸排阻色谱分析级分。

25.根据权利要求24的方法，其中合并包含至少约95％DsbA的级分。