[发明专利]高度并行准确测量核酸的方法

说明书

联邦资助科研的相关声明

本发明在美国国家卫生研究院签署的TR000140和TR000142框架下获得了政府支持。因此，政府在本发明中享有某些权利。

交叉参考相关的专利申请

本申请要求2015年2月13日提交的第62/116,302号美国临时专利申请和2015年3月20日提交的第62/135,923号美国临时专利申请的权益。

技术领域

本发明涉及溶液中核酸的识别和定量。

发明背景

生物医学研究和临床医学的许多应用依赖于核酸的准确检测和定量。某些应用依赖于核糖核酸(RNA)水平的测量，以提供基因活性或基因表达的相关信息。还有一些应用依赖于变异体脱氧核糖核酸(DNA)或指示是否存在基因组改变的RNA序列，例如点突变、着生、缺失、易位、多态性或拷贝数目变异。核酸的材料在技术和实际应用方面仍存在许多挑战。通常而言，测量须依赖于大量取样。此外，如果包含核酸分子复杂混合物的有限样本中存在极少数的感兴趣的特定核酸序列，则想要可靠地识别和定量低丰度变异体将不是一件易事。

在各种临床和研究样本内分析基因表达有助于增强我们对细胞生理学的理解并从此获知治病方法。辨别复杂生物系统内有意义的基因表达谱通常涉及到在两个方面的统计对比：多个核糖核酸之间和多个样本之间。尽管第一个RNA维度的高度并行分析技术已趋于成熟，但是，对于第二种维度而言，即样本维度，效率仍非常有限。可以使用诸如转录组测序(RNA-Seq)或微阵列等技术获取RNA表达的全基因组图片。但是，由于这些方法涉及到每个样本的独立的多步骤处理，所以不方便进行大型样本多重处理。而且，尽管RNA-Seq成本降低后加快了其广泛应用，但是序列深度和每个样本成本之间仍然存在一定的权衡，这一点限制了测量罕见转录物的灵敏度。

通常在通过全局剖面法确定差异表达RNA的子集后，再使用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)对较大样本集的靶向RNA进行评估。qRT-PCR的准确性、灵敏度和广泛的动态范围使此方法成为验证和进一步测试此类转录物的选择。然而，由于需要在独立的反应体积上执行对荧光性的实时监测，所以，将多基因qRT-PCR化验应用到大量样本将是一件费时费力和成本高昂的事情。尽管可以通过自动化或微流体来改善效率，但是独立的指数式扩增仍然容易导致样本间出现差异。

同时，从复杂的核酸分子混合物中检测并定量低丰度变异体核酸序列也是一件极具挑战的事。当特定样本的DNA或RNA量有限时，在检测变异体序列时很难实现高分析灵敏度。此类方法的应用是在患有癌症的个人的血液中检测少量肿瘤来源的DNA或RNA分子。众所周知，DNA和RNA的片段分子所释放到的血流是来自患有各种恶性肿瘤的患者的临死癌细胞。此类循环肿瘤来源的核酸表现出良好的作为非侵入性肿瘤标志物的前景。在血流中，可以基于是否存在肿瘤特定突变，将肿瘤来源核酸与正常背景DNA或RNA区分开来。然而，此类突变核酸拷贝通常少量存在于相对丰富的正常(野生型)分子的背景中。通常情况下，突变肿瘤来源拷贝在血浆中包含的总DNA或RNA少于1％，而且，丰度有时低至0.01％或以下。因此，检查此类低丰度DNA或RNA时会涉及到分析灵敏度极高的化验。

发明摘要

本文涉及可同时并以高度并行的方式定量许多样本的各种微RNA(miRNA)、信使RNA(mRNA)和其他类的RNA的方法和组合物。这些方法的序列深度远低于现有的数字剖面法。在一个实施例中，在反转录期间分配定量标签，以允许在竞争性扩增和深度测序前进行先期样本混合。此方法旨在提高大型基因表达研究的实际应用能力。

本文还涉及可以从复杂的核酸分子混合物定量低丰度变异体核酸序列的方法和组合物。

发明摘要

本文涉及可对核酸进行简化、灵敏和准确定量的方法和组合物。有些方法可以对多个样本的多个靶向核糖核酸进行高度平行测量。其他方法可以对核酸分子的复杂混合物的低丰度核酸变体进行高度敏感测量。

附图说明

附图1所示为公开的RNA剖面法的示意图。

附图2提供的数据用以支持使用公开RNA剖面法定量多重RNA的准确度。

附图3给出的数据用以验证使用取自人体组织和参照样本的RNA完成此方法的定量特性。

附图4给出人类血液中辐射诱导基因表达变化的高通量测量结果。

附图5提供与多个miRNA剖面平台相对比的数据。