[发明专利]用于准确和灵敏检测S-期DNA合成和细胞增殖的光稳定AIE荧光团

说明书

本发明公开了一种具有AIE特性的生物探针。本发明还提供了其制备方法和用于检测S‑期DNA合成和细胞增殖的用途。所述探针具有叠氮基团，可以与含有端炔基的EdU经由在Cu(I)‑催化配合物进行反应。点击反应后，所述探针变成共价结合至DNA并出现荧光。与商业化的DNA生物探针Alexa647‑叠氮化物染料相比，本发明所述的AIE荧光团表现出更好的光稳定性和灵敏度。

相关申请

本申请要求于2015年4月13日提交的第62/178,511号美国临时申请的优先权权益。上述申请的全文通过引用的方式结合入本申请。

技术领域

本发明涉及具有AIE特性的生物探针、其制备方法及在检测S-期DNA合成和细胞增殖中的用途。

背景技术

DNA是一类载有遗传指令的生物大分子。DNA对于有机体的发育和功能是重要的。S-期是细胞周期的过程之一，其中发生DNA的合成和复制。由于其生物学的重要性，科学家们付出巨大努力开发技术以更好地理解DNA合成，尤其在复杂生物体系中DNA合成的分子机制。这样积极的努力使得开发出许多小分子报告基因，所述报告基因可通过嵌入结合、静电结合和沟槽结合反应与DNA分子结合。放射性探针为选择性标记有丝分裂活跃细胞的早期方法，但其具有一些缺点。首先，放射性试剂具有危险性，并且其高成本和耗时的过程也限制了它们在快速高通量研究中的应用。标记的DNA的显微图像表现出低分辨率和低信噪比。并且，这些标记技术不允许同时用于表征增殖细胞。另一方面，荧光标记法已广泛用作细胞生物学中的“金标准”方法，这是由于其可提供快速检测、高灵敏度和较低的细胞毒性。例如，将5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU，一种胸苷类似物)结合至新合成的DNA证明其相对于使用放射性核苷类化合物具有许多优点。然而，该BrdU试验也具有一些局限性，例如将DNA变性使其可为抗体所靶向、严苛的处理条件(热、酸和核酸酶)，以及限制抗体通过固定的组织进行渗透。最近，报道了一种使用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU，另一种胸苷类似物)的直接S-期检测方法。在这种方法中，具有端基炔官能团的EdU首次被结合至新合成的DNA。炔单元与具有叠氮基团的荧光染料的点击反应(click reaction)被Cu(I)配合物催化，产生染料标记的双链DNA。不同类型的荧光探针被开发用于监测DNA如Alexa Fluor染料的合成过程，其实例为如下作者所报道：Peter T.Czerney(US8039648B2)，F.Hoffmann-La Roche Ag(WO2012031817A1)和Surbhi Desai(US 20100317045A1)。尽管Alexa Fluor染料在检测DNA合成中具有良好的选择性和灵敏度，但它们通常具有普遍存在的现象，该现象被认为是聚集导致的淬灭剂(ACQ)或浓度淬灭。与上述材料相比，具有聚集诱导发光(AIE)特性的有机分子已表现出更好的光稳定性和灵敏度，这使其成为具有前景的替代物。

发明概述

本发明中，设计和合成了新的荧光探针如可用于点击反应的TPE-Py-N₃和Cy-Py-N₃。所述探针具有叠氮基团，可与含有端炔基的EdU经由Cu(I)催化配合物进行反应。点击反应后，所述探针变成共价结合至DNA并出现荧光。所述探针由具有AIE特性的化合物构建，叠氮基团用于点击反应。已发现该染料对DNA合成具有高特异性，并具有较高的光稳定性和高耐褪色性。由于以上优势，我们将所述染料用于监控DNA合成的过程。

附图说明

图1：TPE-Py-N₃和Cy-Py-N₃的合成路线。

图2：Cy-Py-N₃在DMSO-d₆中的¹H-NMR谱图。

图3：Cy-Py-N₃的质谱图。