[发明专利]核糖核酸的无细胞生成

说明书

在一些方面，本文中提供了用于核糖核酸的无细胞生成的方法和组合物。

相关申请

本申请要求2015年3月30日提交的美国临时申请号62/140,407的35 U.S.C.§119(e)下的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

发明背景

RNA干扰(RNAi)是指使用基因的DNA序列使基因“关闭”的细胞机制-一种称为“沉默”的过程。在极其多种生物体(包括动物、植物、和真菌)中，RNAi由双链RNA(dsRNA)触发。已经在活细胞中和体外使用纯化的重组酶和纯化的核苷酸三磷酸生成双链RNA(例如治疗性dsRNA)(参见例如欧洲专利号1631675 A1和美国专利申请公开号US2014/0271559 A1)。然而，使用此类系统的dsRNA的大规模生产是挑战性的、低效的且昂贵的。

发明概述

本文中提供了用于RNA(包括dsRNA)的无细胞生成(也称为生物合成)的平台。本公开的方法、组合物(例如，细胞和细胞裂解物)、和系统基于涉及将聚合RNA(例如，mRNA、tRNA和/或rRNA)无细胞(例如，使用细胞裂解物)降解成单磷酸和二磷酸核糖核苷酸单体的方法。在RNA降解后，将单磷酸和二磷酸核糖核苷酸单体转化为核糖核苷酸三磷酸，然后将核糖核苷酸三磷酸聚合形成期望的RNA(例如dsRNA)。

因此，本公开提供了生成用于核糖核酸(RNA)的无细胞生成的细胞裂解物的方法。所述方法可以包括：(a)将细胞培养至期望的细胞密度，其中所述细胞包含至少一种工程化核酸，所述工程化核酸含有与编码核酸酶(例如，S1核酸酶、NucA、PNP酶、RNA酶II、RNA酶III、或RNA酶R)的序列可操作连接的启动子，所述核酸酶包含蛋白酶识别位点并且与周质靶向序列连接，其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶(例如，RNA酶III、RNA酶I、RNA酶R、PNP酶、RNA酶II、和/或RNA酶T)遗传失活或经由靶向蛋白水解失活；(b)裂解步骤(a)中生成的细胞，从而生成第一细胞裂解物，并且(c)在导致RNA解聚和NMP和NDP磷酸化的条件下温育所述第一细胞裂解物，从而生成含有核苷酸5’-单磷酸(或核苷酸5’-单磷酸和核苷酸5’-二磷酸的混合物)的第一细胞裂解物。

在一些实施方案中，方法还包括(d)培养细胞，所述细胞包含(i)至少一种工程化核酸，其含有与编码关联蛋白酶的序列可操作连接的启动子，所述关联蛋白酶切割所述核酸酶或靶向性内源RNA酶的蛋白酶识别位点，其中所述关联蛋白酶(例如，人鼻病毒3C蛋白酶)与周质靶向序列连接，(ii)至少一种工程化核酸，其含有与编码核苷酸激酶(例如，尿苷酸激酶、胞苷酸激酶、鸟苷酸激酶、腺苷酸激酶、核苷磷酸激酶、丙酮酸激酶、和多磷酸激酶)的序列可操作连接的启动子，(iii)至少一种工程化核酸，其含有与编码RNA聚合酶的序列可操作连接的启动子，和(iv)工程化脱氧核糖核酸(DNA)模板，其含有与编码RNA转录物的序列可操作连接的启动子，其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶遗传失活或经由靶向蛋白水解失活；并且(e)裂解步骤(d)中生成的培养细胞，以生成第二细胞裂解物。

在一些实施方案中，方法还包括组合步骤(b)中生成的所述第一细胞裂解物、步骤(e)中生成的所述第二细胞裂解物、和多磷酸盐和/或葡萄糖，从而生成混合物；并且在导致RNA(例如dsRNA)生成的条件下温育所述混合物。

在一些实施方案中，方法包括(a)将细胞培养至期望的细胞密度，其中所述细胞包含(i)至少一种工程化核酸，所述工程化核酸含有与编码核酸酶的序列可操作连接的启动子，所述核酸酶包含蛋白酶识别位点并且与周质靶向序列连接，和(ii)至少一种工程化核酸，所述工程化核酸含有与编码核苷酸激酶的序列可操作连接的启动子，其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶遗传失活或经由靶向蛋白水解失活；(b)裂解步骤(a)中生成的细胞，从而生成第一细胞裂解物，并且(c)在导致RNA解聚的条件下在将所述第一细胞裂解物与多磷酸盐和/或葡萄糖一起温育，从而生成含有核苷酸5’-三磷酸的混合物的第一细胞裂解物。