[发明专利]新型赖氨酸脱羧酶及利用其制备尸胺的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型赖氨酸脱羧酶、用对该赖氨酸脱羧酶活性进行编码的基因转化的微生物以及利用其制备尸胺的方法。

背景技术

利用二胺(diamine)的尼龙的一般制备方法依赖以1,4-丁二胺(1,4-diaminobutane)和己二胺(hexamethylenediamine)为原料的化学工艺。由于利用以石油基础的有机化合物来制备该原料物质，因此在环境规制得到强化的同时，关于随基于生物的途径而产生的代替物质的市场需求日益强烈。

另外，尸胺为具有分子式NH₂(CH₂)₅NH₂且由五个碳原子构成的二胺(diamine)有机化合物，从而尸胺可以是尼龙5,6的原料物质。如果以生物为基础制备尸胺，则被预测为能够满足基于生物的市场需求的同时生产各种尼龙。

与以生物为基础制备尸胺相关联地，在1940年以前已知有使赖氨酸生物转换的研究(Gale E.F.,Epps H.M.1944.Studies on bacterial amino-acid decarboxylases.Biochem J.38,232-242)。作为生物转换的核心步骤的赖氨酸脱羧酶为从赖氨酸生成尸胺的酶(图1)。报道了在各种微生物中的赖氨酸脱羧酶的活性，酶特异性活性(specific activity，mmol/min/mg)已知的赖氨酸脱羧酶从四种微生物(大肠杆菌(Escherichia coli)、尸杆菌(Bacterium cadaveris)、大豆(Glycine max)和反刍月形单胞菌(Selenomonas ruminantium))得到。其中，来源于大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶被评价为呈现最高活性的赖氨酸脱羧酶，实际生产中所应用的酶也局限于来源于大肠杆菌的CadA(日本专利第2005-147171号、欧洲专利第2004-010711号及日本专利第2002-257374号)。但是，在使赖氨酸脱羧酶与赖氨酸反应来生成尸胺的情况下，由于赖氨酸的脱羧而产生二氧化碳，并且因从作为一阶阳离子的赖氨酸生成作为二阶阳离子的尸胺而在反应过程中pH不断上升。由此，上述赖氨酸脱羧酶出现如下问题：在进行酶反应时，伴随pH变化而效率降低。此外，也有可能因反应溶液中所生成的酸或碱基导致酶变性而丧失活性。

由此，本发明人通过挖掘对高温及pH具有稳定性的新型赖氨酸脱羧酶，并且确认该赖氨酸脱羧酶能在埃希氏菌属菌株中表达，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供一种新型赖氨酸脱羧酶以及对具有该赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质进行编码的多核苷酸。

本发明的另一目的在于提供一种被转化成表达上述赖氨酸脱羧酶的微生物。

本发明的又一目的在于提供一种利用上述酶和包含该酶的微生物来制备尸胺的方法。

技术手段

在本发明的一具体方式中，提供一种具有新型赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质，上述蛋白质包含序列号1的氨基酸序列或者与该序列号1的氨基酸序列具有75％以上的序列同源性的氨基酸序列。

在本发明中，术语“具有赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase)活性的蛋白质”是指能够通过将5'-磷酸吡哆醛(pyridoxal-5'-phosphate)作为辅酶使用来催化赖氨酸的脱羧反应，由此使赖氨酸脱羧而生成尸胺(cadaverine)和二氧化碳的具有活性的蛋白质。

包含序列号1或与该序列号1具有75％以上的序列同源性的氨基酸序列的上述具有赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质可以是从来源于假单胞菌属的微生物中新发掘的具有赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质，该蛋白质可以包括具有相应活性且在假单胞菌属的微生物中发现的所有蛋白质。例如，上述假单胞菌属菌株可以是耐热假单胞菌(Pseuodomonas thermotolerans)、产碱假单胞菌(Pseuodomonas alcaligenes)、食树脂假单胞菌(Pseuodomonas resinovorans)、恶臭假单胞菌(Pseuodomonas putida)和产黄假单胞菌(Pseuodomonas synxantha)。