[发明专利]改进的小滴测序装置和方法

说明书

本发明涉及用于对多核苷酸(如例如源自天然来源的遗传物质的RNA和DNA片段或其合成的类似物)进行测序的改进的装置和方法。

遗传物质的下一代测序已经对生物科学整体上和特别地对医学产生显著的影响，原因在于测序的单位成本降低，与越来越快的测序仪投放市场一致。在我们之前的申请WO 2014/053853和WO 2014/053854中，我们描述了新的测序方法和相关装置，其涉及逐步消化多核苷酸分析物以产生单个-核碱基核苷酸(下文为‘单个核苷酸’)流，优选通过焦磷酸解产生的其有序的流，其每一个可以逐个被捕获到微滴流中的相应小滴中。之后，可以化学和/或酶操作每个小滴以揭示其最初包含的特定单个核苷酸。在一个实施方案中，这些化学和/或酶操作包括涉及使用一种或多种两组分寡核苷酸探针类型的方法，所述两组分寡核苷酸探针类型中的每个适于能够选择性捕获构成分析物的单个核苷酸类型中的一种；例如在天然存在的DNA的情形中，对应于核碱基胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和腺嘌呤的四种类型中的一种。通常，在每个这样的探针类型中，两种寡核苷酸组分中的一种包含不同的和特征性荧光团，并且在探针的未使用状态，这些荧光团发荧光的能力由于位于附近的猝灭剂的存在或通过自猝灭保持不存在。之后，一旦特定探针捕获其相应的单个核苷酸，其变得容易受外切核酸酶降解影响，由此引起荧光团与所述猝灭剂分离和/或彼此分离，并且由此使它们能够在其特征波长自由发荧光。通过这种方式，每个小滴中最初存在的单个核苷酸的性质可以从光谱分析推断。

J.Biotech.102(2003)，第1-14页，US2008/0194012和Lab on a Chip(2012)，第906-915页教导了用于各种不同目的的珠子的真空固定。

我们现在开发了用于这种类型的测序方法的装置的改进的版本，其允许初始多核苷酸消化步骤容易地且可靠地进行，并且以能够利用数千个小滴产生位点多重地工作的方式进行。该改进涉及首先将要分析的多核苷酸(下文为分析物)固定在颗粒的表面，并且之后将所述颗粒固定在所述装置内的位置，在所述位置，通过跨越它施加负压力梯度发生消化。我们了解，US6471917之前已经描述了将小的固体珠子置于有组织的阵列中的系统和技术，但就我们所知，这样的技术尚未应用于在流动中持有单个分子或单个分子测序应用。

因此，根据本发明的第一方面，提供对多核苷酸分析物进行测序的装置，所述装置包括：

●第一区域，在其中通过逐步消化与颗粒连接的分析物的分子产生单个核苷酸流，所述颗粒位于所述第一区域中并且暴露于流动的水性介质；

●第二区域，在其中从所述水性介质和所述核苷酸流产生相应的水性小滴流，并且其中至少一些小滴含有单个核苷酸，和

●第三区域，在其中储存和/或询问每个小滴以揭示所述小滴中可能含有的单个核苷酸特有的性质；

其特征在于，所述第一区域包括微流体通道，所述水性介质通过所述微流体通道流动，并且位置在其壁中包括中空的基座，可以向所述基座中施加抽吸，并且所述颗粒可以紧密匹配在所述基座中。