[发明专利]从形质转化蚕茧提取的荧光丝蛋白质溶液的制备方法及利用其的载体制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及添加了还原剂的荧光丝蛋白质制备方法，更详细地，涉及一种用于利用还原剂在使形质转化蚕茧保持荧光的同时获得大量蛋白质的荧光丝蛋白质制备方法及利用其的载体制备及应用。

背景技术

丝纤蛋白（silk fibroin）是从蚕提取并制备的典型的天然高分子物质，长期以来一直用作织物的纤维材料及诸如缝合线的医疗工程学材料。当丝纤蛋白应用于活体时，几乎不引起炎症反应，且对成纤维细胞或角质细胞等的细胞附着能力和增殖效果出色，从而作为活体适合性优秀的人工皮肤的材料受到大量关注。另外，不同于其它的天然高分子材料，丝纤蛋白可以通过昆虫而容易地大量获得纯蛋白质，活体适合性优秀，从而即使不经过特别的精制过程，也几乎不出现对人体的排异反应，具有可以成型为粉末、膜、多孔质体及凝胶等各种形态的特征。

绿色荧光蛋白质（Green Fluorescent Protein,GFP）由日本海洋生活学者下村修于1962年在研究水母（Aequorea victoria）的荧光物质的过程中首次发现，1969年被Hasting和Morin命名为绿色荧光蛋白质。GFP在活体内作为搬运被钙激活的发光蛋白质（Photoprotein）或荧光素酶-氧化荧光素复合体的能量的能量传递受体进行作用，从水母素（Aequorin）接受能量，作为释放508nm的绿色荧光的2次荧光蛋白质而进行作用。当在细胞中存在对该GFP进行编码的DNA或mRNA时，GFP蛋白质在细胞内合成而发出强烈的荧光。如果将对GFP进行编码的序列连接于想要调查表达程度的基因，则使得GFP在希望实际调查的基因进行表达的场所表达荧光，因此在调查基因表达方面大量使用。特别是由于观察容易、不具毒性的优点，在基因表达的有无、场所、时间测量等各种的领域使用。还开发了与其功能上类似的黄荧光蛋白质（YFP）、青绿色荧光蛋白质（CFP），此外，还制成有红色、黄色等各种颜色的荧光蛋白质。如此各种的荧光蛋白质在要一次性获知多个蛋白质的地区分布时被有效地使用。

形质转化蚕是将北美产水母的绿色荧光基因插入作为茧丝（从蚕茧抽取的丝）主成分的丝心蛋白（fibroin构成蚕茧纤维的纤维蛋白质）基因后，将其利用微细注射装置注入蚕卵而形成。该蚕是形质转化非常困难的实用品种。相比于从日本开发的多化性（一年多次孵化的性质）品种为对象的形质转化蚕，能够生产3倍以上的绿色荧光丝。特别是在将基因注入蚕卵时，确保指明最佳微细注射位置的独创性核心技术，使形质转化效率提高平均为42.5%，提高最大为75%，远远高于日本10%左右的形质转化效率。从形质转化蚕中提取的绿色荧光丝，如果照射特定波长的光，则在黑暗中显示绚丽的绿色荧光，即使在自然光下，也带有淡绿色。再者，与用于丝生产的精炼过程中颜色消失的彩色茧或黄金茧不同，即使进行精炼，保持依然的绿色荧光。绿色荧光基因传递至下一代。因此，无需另外的染色处理，便可以用作时装、壁纸、灯罩、饰品、装潢用品等的材料。

用于制作荧光丝纤蛋白载体的溶液，以现有制备方法无法保持荧光。绿色荧光蛋白质（GFP）与强盐反应的情况下失去荧光。因此，就现有丝纤蛋白溶液而言，作为制备方法，在将通过精炼而获得的丝纤蛋白纤维制备成溶液的过程中，利用作为强盐的9.5M的LiBr水溶液进行溶解，因而难以保持GFP的荧光。另外，不同于现有B.mori，无法很好地溶于9.5M LiBr水溶液，在溶液制备方面存在限制。

发明内容

技术课题

为了解决所述问题，本发明为了利用荧光蚕茧在保持荧光的同时制备溶液并制备利用其的载体而进行研究的结果，发明了添加还原剂的制备方法。

技术方案

因此，本发明提供一种制备荧光丝纤蛋白溶液的方法，其特征在于，包括：a）将荧光蚕茧放入包含精炼剂的水溶液中，在8-24小时期间加热到40-60℃后，用蒸馏水清洗而获得精炼的荧光丝纤蛋白的步骤；b）在每9-9.6M LiBr 100mL混合有二硫苏糖醇（Dithiothreitol,DTT）15mg-1.5g的溶剂中，在40-60℃下溶解所述精炼的荧光丝纤蛋白1-5小时的步骤；及c）在一次蒸馏水中透析所述溶解的荧光丝纤蛋白48-96小时的步骤。优选地，所述精炼剂包含碱性蛋白酶（alcalase）及碳酸氢钠（NaHCO₃）。

本发明还提供一种组织再生用载体，所述组织再生用载体包含以所述制备方法制备的荧光丝纤蛋白溶液。

本发明还提供一种生物成像用组合物，生物成像用组合物包含以所述制备方法制备的荧光丝纤蛋白溶液。

发明效果