[发明专利]一种检测嘧霉胺残留的ELISA检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶联免疫检测试剂盒以及农药残留检测方法，更具体地说，是一种利用酶联免疫分析技术检测水果盒蔬菜中嘧霉胺的残留，属于酶联免疫检测（ELISA）技术领域。

技术背景

嘧霉胺（Pyrimethanil）是近年来开发的一种苯胺基嘧啶类广谱低毒杀菌剂，对果蔬中的枯萎病以及草莓、黄瓜等作物的灰霉病等具有极好的防治效果，此外，在果蔬运输过程中可作为抑霉剂，从而起到保鲜防腐的作用。嘧霉胺具有独特的作用机理，可抑制病原菌中侵染酶的产生以阻止病原菌入侵，其具有叶片穿透及根部内吸活性，能迅速传递至作物体内各部位。随着农作物病虫害发生率的日益增长，农药的使用量也随之增加，农药残留问题由此获得国内外科研工作者的广泛关注。我国强制性国家标准规定水果和蔬菜中嘧霉胺的最高残留量为7 mg/kg（柑橘类水果等）和3 mg/kg（葱、菜豆等），另外日本等国家也对我国出口的果蔬中嘧霉胺的残留量制定了严格的标准。

目前报道的有关嘧霉胺残留的分析方法有气相色谱法（NPD检测器）、高效液相色谱法、气（液）相色谱-质谱连用等，但这些方法都存在回收率低、检测样品前处理程序繁琐、检测周期长等缺点。因此，迫切需要一种快速简便的新方法来检测嘧霉胺。酶联免疫法（ELISA）是一种敏感、快速且效率极高的检测分析方法与传统的检测方法相比，其具有样品处理简单、检测速度快、方法简便等优点。有关于果蔬中农药残留检测分析的ELISA试剂盒方法的报道很多，但目前仍未见到利用酶联免疫方法检测嘧霉胺残留的报道。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种检测水果和蔬菜中嘧霉胺残留的酶联免疫检测试剂盒以及检测方法，其中，嘧霉胺多克隆抗体为该试剂盒中最为主要的成分，该试剂盒具有高灵敏度、高特异性等优点，可高效、快速检测果蔬中的嘧霉胺残留，能批量制作应用于农业生产实践中。

本发明提供的一种嘧霉胺多克隆抗体的制备方法，其特征在于：将乙腈、2-氯-4,6-二甲基嘧啶、吡啶加至三口烧瓶中，将烧杯置于磁力搅拌器上，并于反应器内放置温度计，在50~60 ℃下滴加对氨基苯乙酸，反应后，TLC跟踪直至原料消失，然后降温至30 ℃，将反应产物过层析柱子，收集半抗原产物；将半抗原与载体蛋白进行偶联，得到嘧霉胺人工抗原；利用嘧霉胺人工抗原对小型哺乳动物进行免疫，所得到的多克隆抗体即为嘧霉胺多克隆抗体。

其中，包被有嘧霉胺包被抗原的酶标板制备过程中所使用的包被抗原是嘧霉胺抗原与卵清蛋白的偶联复合物，包被缓冲液为0.05 mol/L PH 9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，封闭液为1 %的BSA/PBS缓冲液。

其中，洗涤液为PH 4.7的PBST溶液，其配制步骤如下：取Na₂HPO₄·12H2O 68.8 g，NaH₂PO₄ 6.9 g，NaCl 45 g，加双蒸水至1000 mL，PH调至7.4。

其中，酶标记物为酶标二抗，标记酶为辣根过氧化物酶。

其中，底物显色液为TMB-过氧化氢脲溶液，配制步骤如下：底物液A：取无水乙酸钠8.2 g，β-糊精2.5 g，过氧化氢脲428.6 mg，加双蒸水至1000 mL，调节PH至5.0，4℃保存；底物液B：取100 mg TMB溶于10 mL DMSO中，棕色瓶保存；使用前取14.6 mL底物液A和0.45 mL底物液B混合15 min。终止液为1.25 mol/L的H₂SO₄。

本发明提供的利用试剂盒检测嘧霉胺农药残留的方法，步骤如下：

1、称取果蔬中可食用部分10 g放入研钵中，加入10 mL提取液，充分研磨过滤，收集的滤液即为待测样品。

2、取待测样品和包被缓冲液加入孔内，并设置阳性对照（嘧霉胺标准品包被），37 ℃包被30 min。洗涤，沥干，其中，用洗涤液洗涤3 次，每次3 min。

3、每孔加入0.4 mL封闭液封闭30min，清洗后沥干。

4、每孔加入0.1 mL嘧霉胺抗体，37 ℃孵育40min后洗涤3次。

5、每孔加入0.1 mL酶标二抗羊抗兔（HRP）抗体，37 ℃孵育40min后洗涤3次。

6、每孔加入0.1 mL底物显色液（现用现配）37 ℃孵育20min。

7、每孔加入0.05 mL终止液。

8、利用酶标仪于450nm、655nm波长测定各孔OD值。将嘧霉胺待测样品OD值与标准品进行对比。