[发明专利]豌豆耐寒相关SSR引物组合及其应用

说明书

本发明提供了豌豆耐寒相关SSR引物组合及其应用，属于作物分子辅助育种技术领域。本发明提供35对与豌豆耐寒相关的SSR引物组合，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑70所示，利用PCR扩增技术、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对耐寒或不耐寒豌豆进行鉴定，可在短时间内完成豌豆耐寒特性鉴定工作，具有高效、准确、操作方便、鉴定结果不易受环境和季节影响等优点。本发明的方法从DNA水平揭示耐寒或不耐寒豌豆品种的遗传变异与亲缘关系，为豌豆品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术支持，可应用于农业领域中豌豆种质资源或品种的耐寒鉴定及分子辅助育种，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及作物分子辅助育种技术领域，特别是涉及豌豆耐寒相关SSR引物组合，以及基于该SSR引物组合构建的耐寒或不耐寒豌豆指纹图谱以及鉴别耐寒豌豆的方法。

背景技术

豌豆(Pisum sativum L.)是我国主要的食用豆类之一，栽培历史悠久，营养丰富，粮、菜、饲兼用，同时由于其具有生物固氮作用，是种植业结构中重要的间套轮作作物，可提高土壤肥力，增加作物产量。豌豆适应性强，地理分布广，在全世界超过90个国家广泛种植，作为世界第四大食用豆类作物，其栽培面积和产量仅次于大豆、菜豆和鹰嘴豆。统计数据表明，中国无论是干豌豆还是青豌豆，在栽培面积和总产量方面均跻身全球前列，奠定了中国豌豆生产大国的重要地位。豌豆富含优质蛋白质和多种营养元素，可提高人体免疫力，在改善我国居民膳食结构中同样发挥着重要作用。

根据播种季节，豌豆可分为春播区和秋播区，其中秋播豌豆在我国豌豆生产中占据主导地位。但是对于秋播豌豆来说，生产上面临的一个显著问题是，冬季的严寒可能会导致幼苗死亡，进而需要重新播种甚至遭受产量损失。因此，筛选耐寒豌豆种质资源和品种对于我国豌豆的稳定生产具有重要意义。目前对豌豆品种进行耐寒鉴定的主要方法是进行田间越冬能力的表型鉴定。该方法虽然比较简便、直观，但费时费工，易受生长季节和环境影响，且存在主观偏差，不能精确、快捷地为豌豆品种的耐寒鉴定提供科学依据。

随着分子生物学技术的发展，基于DNA多态性的分子标记技术逐渐成为生物基因分型、遗传多样性分析、品种鉴定以及分子辅助育种的重要工具。在作物遗传分析中常用的分子标记主要有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR等。其中，SSR标记因其在基因组中散在分布，具有多态性丰富，操作便利，共显性且高度可重复性等优点，已被广泛应用于植物种质资源研究和分子辅助育种实践中。虽然目前针对豌豆开发的SSR标记有很多，但这些标记具有随机性，无法对豌豆耐寒品种进行有效鉴定。

发明内容

本发明的目的在于：针对当前鉴定豌豆品种耐寒特性只能在大田里进行，表型鉴定周期长、工作量大且繁琐、易受生长季节和环境影响以及存在主观偏差等一系列问题，提供与豌豆耐寒相关SSR引物组并利用这些引物对豌豆品种进行耐寒鉴定。

为实现上述目的，本发明经过3年3地的大田耐寒表型鉴定，筛选出13份耐寒资源和17份不耐寒资源，并通过豌豆全基因组关联分析，筛选得到与豌豆耐寒显著相关的35对SSR引物。以这30份代表性豌豆种质资源基因组DNA为模板，利用上述35对耐寒相关SSR引物组成的分子标记组合可完全鉴别耐寒豌豆。所述的30份代表性参试豌豆材料见表1。

表1 30份代表性豌豆种质资源

经过严格筛选，选择与豌豆耐寒性状显著相关、PCR扩增稳定，同时满足常规非变性凝胶电泳检测技术平台，最终筛选出在豌豆耐寒和不耐寒资源间差异显著、资源内部遗传一致性高、重复性好、扩增带型清晰度高的SSR引物作为与豌豆耐寒相关的SSR引物组合。