[发明专利]一种去甲基金霉素生物合成基因簇及其应用

说明书

本发明公开了一种分离的去甲基金霉素生物合成基因簇以及包含其的重组表达载体、转化子及其应用，所述基因簇中整合有42个基因。本发明通过将该去甲基金霉素完整生物合成基因簇整合到产去甲基金霉素的天然金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)当中得到了基因工程菌，使其相比于天然金色链霉菌的去甲基金霉素发酵产量提高了34％。

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一种去甲基金霉素生物合成簇及其应用。

背景技术

四环类抗生素去甲基金霉素(DMCTC)的抗菌谱与四环素、金霉素相近，而其作用比四环素强、比金霉素稳定。且其具有高效和长效性质，口服吸收迅速，食物对其吸收无明显影响。其对敏感金葡菌、肺炎球菌、溶血性链球菌、草绿色链球菌、淋球菌等的作用比四环素强2-4倍；对四环素的耐药菌及耐青霉素的部分金葡菌、粪肠球菌和大肠杆菌液有一定抗菌活性。DMCTC亦可作为中间体合成第二代和三代四环类抗生素米诺环素、替加环素和四环素类抗生素衍生物氨甲环素(PTK0796)。替加环素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)效果显著，PTK0796可作用于包括MRSA和耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)在内的许多革兰氏阳性菌。

传统的四环类抗生素基因簇克隆是利用Cosmid或Fosmid建立基因文库，然后进行高通量筛选的方法。1995年T.Dairi等利用Cosmid克隆到菌株金色链霉菌(Streptomycesaureofaciens)NRRL 3203的去甲基金霉素(DMCTC)合成簇部分片段(DAIRI T,AISAKA K,KATSUMATA R,et al.A SELF-DEFENSE GENE HOMOLOGOUS TO TETRACYCLINE EFFLUXINGGENE ESSENTIAL FOR ANTIBIOTIC PRODUCTION IN STREPTOMYCES-AUREOFACIENS[J].BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY,1995,59(10):1835-1841.)，1999年Ryan等利用Fosmid克隆到菌株金色链霉菌ATCC 13899的金霉素(CTC)生物合成簇(Ryan.Cloning of the Biosynthetic Pathway for Chlortetracycline andTetracycline Formation and Cosmids Useful Therein:US,08/474933[P].1999.2.2.)，2013年Zixin Deng等利用Fosmid建库克隆到菌株金色链霉菌F3的CTC完整合成簇(Zhu T,Cheng X,Liu Y,et al.Deciphering and engineering of the final step halogenasefor improved chlortetracycline biosynthesis in industrial Streptomycesaureofaciens[J].Metab Eng,2013,19:69-78.)。去甲基金霉素的完整生物合成簇至今没有文献或专利报道。但无论是利用Cosmid还是Fosmid建立基因组文库的方法，筛选工作量都很大。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题是针对现有的去甲基金霉素的完整生物簇没有被完整克隆得到的现况，提供一种去甲基金霉素完整生物合成基因簇及其应用。

本发明人通过诸多试验和努力，惊奇地发现通过TAR(transformation-associated recombination)方法，利用酵母体内天然的同源重组优势，大片段生物合成基因簇与线性化载体在酵母体内同源重组为完整质粒，实现了一步从去甲基金霉素产生菌金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)中克隆目标生物合成簇，并进一步制备了其重组表达载体、转化子，特别是其基因工程菌发酵生产去甲基金霉素的产量较其天然菌(野生菌)有了大大地提高。