[发明专利]植物体内还原型谷胱甘肽的原位在线检测方法

权利要求书

1.用于植物体内还原型谷胱甘肽原位在线检测的微电极生物传感器，其特征在于，所述微电极的基底电极材料为硅片，硅片上设有三电极体系，包含Ag/AgCl参比电极，铂对电极以及表面修饰有谷胱甘肽氧化酶的金工作电极；

所述微电极生物传感器的制备方法包括以下步骤：

1)采用微机电技术在硅片基底上制备铂对电极、Ag/AgCl参比电极以及金工作电极；

2)将制备好的微电极置于0.5M稀硫酸溶液中，在-0.2-1.6V电位下进行循环伏安扫描，得到典型的循环伏安谱图，保证电极表面清洁；

3)制备Fe₃O₄NPs纳米颗粒：取摩尔质量比为20:1的FeCl₃和FeCl₂溶解在双蒸水中，加入一定量的盐酸使铁盐完全溶解，然后向其中逐滴加入氢氧化钠溶液至溶液颜色由淡黄色变为棕色最后直至深黑色；用磁铁将黑色沉淀物收集在一起，水洗，然后用TMOH冲洗一次，离心，收集沉淀，得到氧化Fe₃O₄NPs颗粒，将沉淀用硝酸洗一次，然后在80-90℃搅拌条件下，使颗粒悬浮于0.01-3M硝酸中，直至变成棕色；最后经过水洗，将Fe₃O₄NPs纳米颗粒悬浮于pH值11的TMOH溶液中；

4)取上述Fe₃O₄NPs纳米颗粒TMOH悬浮溶液，用1-100mM柠檬酸钠溶液稀释，搅拌10min以上，使柠檬酸根离子均匀包裹住Fe₃O₄纳米颗粒；用磁铁收集柠檬酸根化的Fe₃O₄纳米颗粒，并重新分散到1-100mM柠檬酸钠溶液中使其浓度为0.1-5mg/ml，加入终浓度为0.1-100mM的硝酸银溶液，超声15min，搅拌下加热至沸腾，立即加入硼氢化钠溶液，硼氢化钠与硝酸银的摩尔质量比为1:1-1:200，10-60min后停止加热持续搅拌至冷却，得到Fe₃O₄-Ag核壳结构纳米粒子；

5)将Fe₃O₄-Ag核壳结构纳米粒子沉积在金工作电极上，得到Fe@Ag/Au电极；

6)制备壳聚糖与谷胱甘肽氧化酶混合液：将pH值7.3的PBS缓冲液配制的18mg/mL谷胱甘肽氧化酶酶液与1.0％壳聚糖溶液等体积混合；其中，所述1.0％壳聚糖溶液的配制方法如下：将0.1g壳聚糖溶解在10mL 0.05M醋酸溶液中，然后经孔径0.45μm的滤膜过滤，即得；

7)将步骤6)所得混合液滴涂在Fe@Ag/Au电极表面，晾干，即得表面修饰有谷胱甘肽氧化酶的金工作电极，从而完成微电极生物传感器的制备。

2.根据权利要求1所述的微电极生物传感器，其特征在于，所述微电极为贴片式微电极，表面贴有保护膜；所述贴片式微电极的工作电极为直径5-10mm的金属圆片，参比电极为直径8-16mm的圆环，环宽为2-3mm，长度为3/5整环周长，对电极是与参比电极相同直径和宽度的圆环，长度为1/4整环周长，参比电极和对电极分别呈环形半包围于所述金属圆片的外侧，硅片上设置有三根导线，分别与上述三个电极相连，导线的另一端用于连接电化学工作站；所述硅片基底呈薄片状，厚度小于2mm，金属电极片厚度小于1mm。

3.根据权利要求1所述的微电极生物传感器，其特征在于，所述微电极为插入式微电极；所述插入式微电极长2-8cm，其尖端部分长5-30mm，宽2-5mm；所述硅片基底的尖端上中间布设有金工作电极，两边分别布设Ag/AgCl参比电极、铂对电极；裸露金工作电极直径0.5-2mm，Ag/AgCl参比电极直径0.2-0.5mm，铂对电极直径0.2-0.5mm；硅片基底的另一端较宽，其上布设有三根导线，分别与上述三个电极相连，导线的另一端用于连接电化学工作站。

4.利用权利要求1-3任一项所述微电极生物传感器对植物体内还原型谷胱甘肽进行原位在线检测的方法。