[发明专利]重组酿酒酵母及其在合成丙谷二肽中的应用

权利要求书

1.重组酿酒酵母，含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的外源性基因。

2.权利要求1所述的重组酿酒酵母的制备方法，是将来源于鞘氨醇杆菌属的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的外源性基因克隆后连接至表达载体，然后将所构建的重组载体转入作为表达宿主的酿酒酵母细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的表达载体是pYD1。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的表达宿主是酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae EBY100。

5.丙谷二肽的生物合成方法，其特征在于，包括使用权利要求1所述的重组酿酒酵母对底物的转化反应的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的底物包括羧基组分和胺组分，其中所述的羧基组分选自氨基酸酯和氨基酸酰氨，所述的胺组分选自氨基酸、C-保护的氨基酸和胺。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺溶于溶剂体系中，并调节pH为8.0～9.0；

(2)将重组酿酒酵母加入步骤(1)所得的体系中进行反应，反应温度10～40℃，反应体系pH值为8.0～9.0；

(3)以pH值不再降低作为反应达到终点的标志，收集反应液离心分离菌体以终止反应。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括对重组酿酒酵母循环利用的步骤。

9.一种丙谷二肽的生物合成方法，包括如下步骤：

(1)克隆核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的目标基因，使用表达载体pYD1构建包括该基因的重组载体，并采用热击法将重组载体转化至大肠杆菌DH5α中；

(2)利用氨苄青霉素抗性基因筛选、PCR及酶切验证步骤(1)所获得的转化子，保存于斜面培养基；

(3)从步骤(2)所得转化子中提取重组表达载体，并转化至酿酒酵母EBY100感受态细胞中，利用缺陷型筛选获得阳性转化子，将阳性转化子活化后接种到种子培养基，待菌体生长至OD₆₂₀＝0.5～5.0时，转接至诱导培养基中，获得重组酿酒酵母细胞；

(4)丙谷二肽的生物合成：将底物L-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-谷氨酰胺溶于溶剂体系中，并加入步骤(3)的培养物，调节pH为8.0～9.0，体系在20±5℃条件下反应，至pH值不再降低作为反应终点，收集反应液分离菌体；

(5)将步骤(4)分离所得菌体加入到新的反应体系中，循环生产丙谷二肽。