[发明专利]一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl‑2siRNA的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于高分子纳米载体靶向基因转染领域，特别涉及一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2 siRNA的制备方法。

背景技术

基因治疗作为一种新型的有效治疗手段，已经引起了研究者们广泛的关注。在多种基因治疗手段中，RNA干扰技术是一种相对高效的生物治疗方法，它能通过双链RNA诱导同源性的信使RNA特异性的降解，从诱导基因沉默。小干扰RNA(siRNA)治疗方法已经被证明是一种有前景的治疗手段，它能够治疗很多固有的和获得性的疾病，包括艾滋病、血友病和肿瘤等等。然而，siRNA本身的特性限制了它的广泛运用，比如：易被降解，与细胞膜相同的表面负电荷和较差的溶酶体逃逸能力。因此，安全高效的载体在基因传递系统中必不可少的。

近些年，各种纳米材料被应用于基因传递系统，包括脂质体、树状大分子、量子点和碳纳米管等等。然而，能够完全克服siRNA传递障碍的载体还是有待开发。在过去的研究中，RGD(环状的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸氨基酸序列肽)多肽修饰的树状大分子包裹的纳米颗粒被应用于负载人骨形态发生蛋白-2来转染骨髓间充质干细胞，结果成功的诱导了干细胞分化成成骨细胞(ZL201310699637.X)。但是，树状大分子的高成本限制了其进一步的临床应用。聚乙烯亚胺是一种功能性水溶大分子，拥有与树状大分子相似的结构性质：丰富的表面氨基官能团和高度支化的结构。这些独特的性质赋予聚乙烯亚胺作为基因传递载体的广泛应用前景。检索国内外相关文献和专利结果表明：以聚乙二醇化的RGD修饰的包裹金纳米颗粒的聚乙烯亚胺为载体，用于靶向基因转染的方法，尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2 siRNA的制备方法，该方法具有易操作，转染条件简单，转染效率高，特异性强等优点，在癌症治疗等方面有良好的应用前景。

本发明将聚乙烯亚胺作为主体，在其表面修饰RGD，聚乙二醇(PEG)，并包裹纳米金颗粒，制备出一种功能化的聚乙烯亚胺纳米颗粒，这种纳米颗粒由于拥有丰富的表面氨基，可以与带负电荷的B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)siRNA通过静电作用相互结合，形成的载体/基因复合物能够通过RGD靶向性的识别人恶性胶质母细胞瘤细胞(U87MG)表面的α_vβ₃整合素，从而进入细胞，实现对肿瘤细胞特异性的癌细胞基因沉默。

本发明的一种功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒(Au PENPs)/Bcl-2 siRNA的制备方法，包括：

(1)将NH₂-PEG-COOH溶液与6-MAL(6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯)溶液混合，搅拌反应8h，得到MAL-PEG-COOH溶液，然后加入RGD-SH(巯基端环状的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸氨基酸序列肽；上海强耀生物科技有限公司)溶液，搅拌反应12h，得到RGD-PEG-COOH溶液；

(2)将步骤(1)中的RGD-PEG-COOH溶液经过EDC·HCl((1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐))和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化后，加入PEI，反应24h，得到PEI-(PEG-RGD)₁₀溶液，然后加入经EDC·HCl和NHS活化的mPEG-COOH(端基分别为羧基和甲氧基的聚乙二醇)溶液，反应24h，得到PEI-(PEG-RGD)₁₀-mPEG₁₀溶液；

(3)将HAuCl₄·4H₂O(198.67μL)溶液加入到步骤(2)中的PEI-(PEG-RGD)₁₀-mPEG₁₀溶液中，搅拌反应30min，然后加入NaBH₄溶液(27.4μL)，搅拌3h，透析，冷冻干燥，得到{(Au⁰)₂₅-PEI-(PEG-RGD)₁₀-mPEG₁₀}；

(4)将步骤(3)中的{(Au⁰)₂₅-PEI-(PEG-RGD)₁₀-mPEG₁₀}用无菌水稀释，然后用DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液稀释Bcl-2 siRNA，再将二者混合均匀后于37℃孵育30min，得到功能化聚乙烯亚胺纳米颗粒/Bcl-2 siRNA。