[发明专利]一种豌豆SSR指纹图谱的构建方法

说明书

本发明公开了一种豌豆SSR指纹图谱的构建方法。本发明提供31对豌豆SSR引物组成的标记组合，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑62所示，利用PCR扩增技术、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳或荧光PCR毛细管电泳检测技术对豌豆品系或豌豆野生近缘种进行鉴定，可在短时间内完成豌豆品系或其野生近缘种鉴定与遗传多样性评价工作，具有高效、准确、操作方便、鉴定结果不易受环境影响等优点。本发明的方法可以对豌豆种子真伪进行有效监控，从DNA水平揭示品种的遗传变异与亲缘关系，保护了作物品种，防止假冒伪劣品种进入市场，也为豌豆品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术支持，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物学和植物品种鉴别技术领域，特别是涉及一种豌豆SSR指纹图谱的构建方法以及利用构建得到的豌豆SSR指纹图谱鉴别豌豆品系或其野生近缘种的方法及应用。

背景技术

豌豆(Pisum sativum L.)属豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Papilionoideae)野豌豆族(Vicieae)豌豆属(Pisum)中的一个栽培中，属一年生(春播)或越年生(秋播)攀岩性草本自花授粉植物。豌豆是世界上第四大食用豆类作物，全球有60多个国家生产干豌豆；我国是世界豌豆主产国，总面积、总产均为世界第一。豌豆适用冷凉气候、多种土地和干旱环境，具有高蛋白质含量、维生素丰富、易消化吸收，粮、菜、饲、肥兼用以及深加工增值的诸多特点，是种植业结构调整中重要的间、套、轮作和养地作物，在我国的可持续农业发展和我国人民食物结构中产生着重要影响。因此开展豌豆品种的有效甄别显得尤为重要。

目前我国对豌豆品种进行鉴定主要方法是按照NY/T 2436-2013《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南豌豆》进行田间测定来鉴定的。该方法简便、经济，但受限于许多形态学性状鉴定周期长、易受环境影响等因素，因此不能精确、快捷地为新品种侵权案件提供鉴定依据，同时也常出现不同测试人员对某些性状的认识存在偏差，导致判定结果不一致的问题。当前，随着育种骨干亲本的利用集中化，传统的形态学测试已经不能适应品种鉴定和纯度分析的要求。

随着生物技术的飞速发展，基于分子标记技术而建立起来的DNA指纹图谱(fingerprint)在品种、品系鉴别方面发挥着重要作用。品种DNA指纹数据库的构建在豌豆品种纯度及真实性鉴定、种子质量标准化、品种审定及产权登记保护、真假种辨别、品种纠纷等方面具有重要应用价值，在探究我国豌豆种质资源的亲缘关系、杂种优势群划分、种质资源创新利用及新品种选育等方面发挥着显著作用。当前用于构建作物DNA指纹图谱的标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、EST、ISSR、SSR等。简单重复序列(Simple sequencerepeat，SSR)，是第二代基于PCR技术的分子标记技术，具有多态性丰富、遗传信息多、操作便利、共显性、高度可重复性等优点，已被广泛应用于植物资源遗传研究和分子辅助育种实践中。

DNA指纹图谱能够从DNA水平上鉴定出品种间的差异或遗传相似性。微卫星(又称为简单重复序列，SSR)是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星序列具有多态性较高，重复性和稳定性好等特点，是十分有效的分子标记，被广泛应用于品种鉴定、指纹图谱构建等领域。为了有效保护我国豌豆的品种知识产权，有必要在我国开展豌豆开发微卫星标记开发，并应用于豌豆优良品种“分子身份证”构建的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种豌豆SSR指纹图谱的构建方法，本发明的另一目的在于提供一种高效、准确、低成本的利用豌豆SSR指纹图谱鉴别豌豆品系或其野生近缘种的方法。本发明的目的还在于提供该方法的应用。