[发明专利]一种丝素荧光探针的制备方法

权利要求书

1.一种丝素荧光探针的制备方法，其特征是采用如下步骤：

1)用丝素材料对噬菌体库进行筛选，得到与丝素蛋白特异性结合的噬菌体；

2)对步骤1)获得的与丝素蛋白特异性结合的噬菌体进行基因测序，将测序获得的基因对应的氨基酸序列作为丝素亲和肽一级序列；

3)通过多肽合成技术对步骤2)得到的丝素亲和肽一级序列进行多肽合成，得到丝素亲和肽粉；

4)将步骤3)得到的丝素亲和肽粉和荧光染料结合，得到丝素荧光探针；

所述步骤1)具体为：

a.封闭丝素材料：将丝素材料加入含有TBS和BSA的缓冲液；

b.丝素材料对噬菌体库的筛选：将噬菌体肽加入到丝素膜的缓冲液中，常温摇床中以160rpm转速下摇振0.5-8h；

c.洗涤：用洗涤液将丝素膜洗涤1-10遍；

d.洗脱：将洗涤液除去，加入洗脱液常温孵育1-20分钟，将与丝素材料特异性结合的噬菌体洗脱下来；

e.中和：加入中和液，使得洗脱后的噬菌体液与中和液混匀后呈中性；

f.噬菌体扩增：将中和后的噬菌体液转入到ER2738菌中，在37℃温度的摇床中以150-220rpm转速摇振3-24h，得到噬菌体和ER2738菌混合液；

g.噬菌体纯化：将噬菌体和ER2738菌混合液进行离心，再加入到PEG和NaCl的混合液中进行纯化，得到亲和丝素材料的噬菌体菌液；

i.上述步骤a～g过程为一次循环，将步骤a～g经过2-6次重复循环之后，得到与丝素材料特异性结合的噬菌体液；

所述步骤a中的丝素材料采用以下方式进行制备：先将蚕丝蛋白粉末溶于有机溶剂或者水中形成蚕丝蛋白溶液，将蚕丝蛋白溶液滴在聚乙烯板上风干，加酒精处理使蚕丝蛋白固化，得到不溶解于水的丝素膜。

2.如权利要求1所述的一种丝素荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中的步骤c的洗涤包括用TBST洗涤液、磷酸盐缓冲液、模拟体液、生理盐水、Tris-HCl缓冲液，洗涤次数为1-10遍；所述步骤1)中的洗脱包括用Gly-HCl洗脱液，酸性、碱性洗脱液；所述步骤1)中的中和液采用Tris-HCl中和液。

3.如权利要求1所述的一种丝素荧光探针的制备方法，其特征在于：所述荧光染料选自以下组中的一种或多种：异硫氰酸荧光素、罗丹明、蓝色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、Alexa Fluor、Cy3、Cy5。

4.如权利要求1所述的一种丝素荧光探针的制备方法，其特征在于：所述的丝素亲和肽粉和荧光染料结合是通过化学接枝法、化学共价交联或者螯合作用的方式将两者进行连接。

5.如权利要求1所述的一种丝素荧光探针的制备方法，其特征在于：制备得到的所述丝素荧光探针用于检测和鉴定丝素材料或者含有丝素蛋白的材料。