[发明专利]一种多效唑人工抗原的合成方法

权利要求书

1.一种多效唑人工抗原的合成方法，其特征在于其由多效唑与4-溴丁酸苄酯、氢氧化钾、氢氧化锂反应得到具有羧基的产物，即半抗原PBBA，用碳二亚胺法将半抗原PBBA与载体蛋白偶联，即得到多效唑人工抗原；步骤为：

（1）半抗原PBBA的合成：

合成路线如下：

称取化合物Ⅰ多效唑5g即17.06mmol和4-溴丁酸苄酯 13.16g即51.19mmol 溶解于二甲亚砜50mL中，加入氢氧化钾 1.05g即18.77mmol，在90℃下搅拌过夜，然后加水30mL，用乙酸乙酯萃取；有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到粗产物；粗品通过制备型-HPLC纯化，得到化合物Ⅱ800mg；

称取化合物Ⅱ600mg即1.25mmol 溶解在四氢呋喃3mL和水2mL混合溶液中，加入氢氧化锂 131.5mg即3.13mmol，并在室温下搅拌2h；反应溶液用乙酸乙酯萃取，将有机层用盐水洗涤，干燥并浓缩，得到粗产物，通过制备型HPLC纯化粗产物，得到半抗原PBBA 200mg；

（2）完全抗原的制备：步骤（1）制备的半抗原PBBA，与KLH偶联得到偶联物完全抗原PBBA-KLH；或与BSA偶联得到偶联物完全抗原PBBA-BSA。

2.如权利要求1所述多效唑人工抗原的合成方法，其特征在于：步骤（2）所述完全抗原PBBA-KLH制备方法如下：

a、称取步骤（1）制备的PBBA 4.3mg，二环己基碳二亚胺3mg，N-羟基琥珀酰亚胺2mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，称为A液，室温搅拌反应4-5h；取6.8mg/mL的匙孔血蓝蛋白KLH 1.47mL，PBBA与KLH摩尔比为4500:1,加入等体积硼酸缓冲溶液，称为B液；在室温条件下逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物PBBA-KLH混合液；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物PBBA-KLH混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原PBBA-KLH。

3.如权利要求1所述多效唑人工抗原的合成方法，其特征在于：步骤（2）所述完全抗原PBBA-BSA制备方法如下：

a、称取步骤（1）制备的PBBA 2mg，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐3mg，N-羟基琥珀酰亚胺2mg，用300μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，称为A液，室温搅拌反应4-5h；称取10mg 牛血清蛋白BSA，PBBA与BSA摩尔比为30︰1，溶解于2mL碳酸钠/碳酸氢钠缓冲溶液中,加入等体积硼酸缓冲溶液，称为B液；在室温条件下逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物PBBA-BSA混合液；

b、透析：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物PBBA-BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，即得完全抗原PBBA-BSA。