[发明专利]重组人VEGF多肽肿瘤疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及医学生物技术及免疫学领域，具体地，涉及人VEGF多肽疫苗的构建方法。

技术背景

研究表明，血管生成在肿瘤的发生发展中具有重要作用，抑制肿瘤血管生成已成为一种新的治疗方法。许多活性因子已被确认参与这个复杂的过程，其中包括：aFGF、bFGF、TGF-α、VEGF等。然而，过去数年所做的研究已确立在肿瘤血管生成中，血管内皮生长因子(VEGF)是目前已知的一个最有效的和最特异的促血管生成因子。在大多数肿瘤中，VEGF mRNA是过度表达的，因而被认为是抑制肿瘤血管生成最有效的靶标。

多种策略已被用来抑制VEGF的作用，其中包括靶向VEGF受体(VEGFR)、使用基因疗法提供反义寡核苷酸、使用可溶性VEGFR、受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂的开发,以及针对VEGF的单克隆抗体。目前最有前景的方法是重组的人源化的小鼠抗人VEGF单克隆抗体。此抗体已经在转移性癌症患者进行过测试。然而,运用抗体进行治疗有很多缺点，重要的是，被动免疫策略牵涉把抗体注入病人体内,它的免疫力是短暂的，因为抗体在机体循环中会很快被清除。其次，单克隆抗体本身也是免疫原，导致其不能长期使用。再者，为了维持有效的免疫必须持续大量给患者输入抗体，患者须承受严重的经济负担。使用疫苗来预防或治疗肿瘤是一种极具吸引力的方式，因为疫苗疗法的预期副作用最小。抗肿瘤疫苗包括完整的细胞疫苗、蛋白质和DNA疫苗,以及肽疫苗；每种类型的抗肿瘤疫苗都有其优点和局限性。用肽制备的抗肿瘤疫苗目前引起研究者很大的兴趣，因为这种形式的疫苗较为安全（没有病原体和致癌物质的潜在威胁）、稳定及容易制备，能够大大降低经济成本。重要的是，相对于被动免疫而言，肽疫苗能够致使机体产生持续的免疫反应和记忆。但是肽疫苗的缺陷在于未经修饰的肽极少具有免疫原性。我们通过将VEGF抗原肽呈递在高度有序、高度重复的Qβ病毒样颗粒上赋予了其极高的免疫原性，有望作为一种有效的方法来预防或治疗肿瘤的发生发展。

发明内容

本发明的目的在于，将人VEGF抗原肽呈递在高度有序、高度重复的Qβ病毒样颗粒上赋予其极高的免疫原性，为肿瘤免疫治疗提供一种新的治疗药物。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种重组人VEGF多肽肿瘤疫苗，其特征在于，利用共表达系统在大肠杆菌BL21（DE3）中同时表达噬菌体Qβ外壳蛋白以及C末端插有人VEGF抗原表位的Qβ外壳蛋白，经纯化后获得在外表呈递有人VEGF抗原表位的Qβ病毒样颗粒。

该融合蛋白疫苗的特点是，用该疫苗免疫小鼠后，小鼠体内可产生高滴度的抗人VEGF抗体，并且该抗体在HUVEC细胞增殖试验中能中和人VEGF₁₆₅的生物学活性。并且利用这种呈递方式获得的同源鼠VEGF多肽疫苗免疫小鼠可对C57BLACK6小鼠体内的TC-1肿瘤细胞起到一定的抑制作用。

附图说明

图1显示了通过共表达纯化后得到的病毒样颗粒；

图2显示重组人VEGF多肽疫苗加铝佐剂免疫小鼠后产生了较好的抗体应答；

图3显示重组人VEGF多肽疫苗加铝佐剂免疫小鼠后产生的特异性抗体在HUVEC细胞增殖试验中能中和人VEGF₁₆₅的生物学活性。

图4显示利用共表达将抗原肽呈递在Qβ病毒样颗粒表面的方式获得的同源鼠VEGF多肽疫苗免疫小鼠可对C57BLACK6小鼠体内的TC-1肿瘤细胞起到一定的抑制作用。

具体实施方式

依照本发明的技术方案，采用人工合成的方法获得人VEGF抗原肽的核酸序列，将其插入噬菌体Qβ外壳蛋白基因的C末端，利用共表达的方式在大肠杆菌BL21（DE3）中同时高效表达噬菌体Qβ外壳蛋白以及C末端插有人VEGF抗原肽的Qβ外壳蛋白，表达产物经超声破碎、硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心的纯化得到外表呈递有人VEGF抗原肽的Qβ病毒样颗粒疫苗。该疫苗与铝佐剂混合后免疫小鼠获得的特异性抗体在HUVEC细胞增殖试验中能中和人VEGF₁₆₅的生物学活性。同时，通过此方法利用与人VEGF抗原肽同源的小鼠VEGF抗原肽构建的疫苗免疫小鼠后能抑制C57BLACK6小鼠体内TC-1肿瘤细胞的生长。

实施例

实施例1：重组人VEGF多肽疫苗原核表达质粒的构建