[发明专利]一种食用菌液体菌种细菌污染检测方法

说明书

本发明提供一种食用菌液体菌种细菌污染检测方法，包括：1)分别对各稀释度的代表污染细菌稀释菌悬液进行NB平板培养计数和荧光染色测定，代表污染细菌为食用菌液体菌种常见污染细菌菌株；根据各稀释度菌悬液平板计数结果(Bq)及相应荧光染色测定结果(Fg)建立标准曲线；2)使用适合滤除食用菌菌丝的滤膜，过滤食用菌液体菌种培养液；随后，离心滤液，弃去培养液，并利用无菌生理盐水洗涤菌体沉淀物，再沉淀后，取无菌水对沉淀细菌细胞再悬浮，并进行梯度稀释；3)对步骤2)中获得的污染细菌系列梯度菌悬液进行染色并测定荧光值，并依据标准曲线计算食用菌液体菌种中污染细菌浓度。该方法可快速、精确测定食用菌液体菌种污染细菌数量。

技术领域

本发明涉及一种液体菌种质量检测的方法，尤其涉及一种食用菌工厂化栽培过程中液体菌种的质量检测方法，属于微生物领域。

背景技术

我国食用菌工厂化产业经历了20多年的发展历程，栽培设施硬件和技术水平均有了巨大的进步与创新。菌种制备作为食用菌工厂化栽培过程的重要环节，逐渐由传统的基于固体培养基料的二级、三级种生产工艺发展为具有纯度高、活力强、周期短、成本低等优点的液体菌种生产工艺。液体菌种的应用大大缩短食用菌栽培周期，为食用菌工厂化高效标准化生产奠定了重要基础，但液体菌种生产过程极易产生细菌污染，并且传统固体菌种质量检查方法很难用来对液体菌种进行质控。

目前文献报道的有关食用菌液体菌种细菌污染的检测方法，主要包括感观判断、显微镜观察、酸碱度测定以及培养检测等。通过颜色、气味以及形态等指标的感观判断，虽然对于菌种发酵早期污染有较高准确度，但对始于发酵后期的污染易造成失误，同时并非所有细菌污染均会形成明显的感官特征，并且主观性的感官判断缺乏统一标准；显微镜观察以及基于酸碱度变化的测定对液体菌种中的少量细菌污染检测精度不够，因此这些方法均可能形成误判，从而可能造成生产上的严重损失。与上述检测方法相比，培养方法可较为准确地判断液体菌种污染状况，但由于培养时间一般需要24小时至48小时，检测时效性较差，可能延误液体菌种最佳接种时间，降低液体菌种发酵设备的利用效率。因此建立快速、精确的细菌污染检测技术，是液体菌种技术安全、高效应用的关键。

有关食用菌液体菌种质量检测的专利技术申请只有1件(CN 105087750A，“食用菌液体菌种检测器”)，是一种用于液体菌种浓度检测的装置。针对液体菌种细菌污染检测的专利申请信息几乎未见。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、精确测定食用菌液体菌种污染细菌数量的检测方法。其基本理念是：运用BAClight染色法对经过了特异性分离的食用菌液体菌种中的污染细菌进行荧光染色，通过建立细菌浓度与荧光定量指标的数学关系模型，快速、精确测定食用菌液体菌种污染细菌数量。

为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种食用菌液体菌种细菌污染检测方法，包括如下步骤：

1)标准曲线制备：

分别对获得的各稀释度的代表污染细菌稀释菌悬液进行NB平板培养计数和荧光染色测定，所述的代表污染细菌为食用菌液体菌种常见污染细菌污染细菌G^-和G⁺类污染细菌中分别至少一种，如：假单胞菌(G^-)和枯草芽孢杆菌(G⁺)；随后根据各稀释度菌悬液平板计数结果(Bq)及相应荧光染色测定结果(Fg)建立标准曲线，以明确每种代表污染细菌数量与荧光值之间线性关系范围。

进一步地，所述的代表污染细菌可以是两种或者多种代表污染细菌株；优选地，所述的标准曲线可以是所使用的代表污染细菌株标准曲线的拟合标准曲线。