[发明专利]一种杆菌类生物标志物灵敏检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及标志物检测技术领域，具体地说，涉及一种杆菌类生物标志物灵敏检测的方法。

背景技术

菌种中主要是杆菌菌属能形成芽孢。从食品的安全角度来讲，某些芽孢杆菌可能会引发食物中毒(如蜡样芽胞杆菌)；虽然已有很多研究工作者通过免疫分析法、染色法、PCR或PCR-ELISA法、流式细胞术、毛细管电色谱等直接或间接的方法来检测芽孢杆菌。然而这些方法存在一些问题，如：使用的试剂或仪器昂贵，需对操作人员培训，操作繁琐且分析时间较长或检测结果定量较难等。

相对来说，用光谱法来检测化学或生物通常比较快，并且只有振动光谱可提供被测物的指纹信息(结构与官能团)。已经有一些光谱法被成功用于杆菌类芽孢的检测，如：光致发光、红外光谱和拉曼或表面增强拉曼光谱(SERS)等。早期已有报道是利用具有很强SERS效应的银纳米粒子作为基底，并证明了SERS手段能够实现生物标志物的快速、灵敏检测。然而，用作生物体系中的SERS基底时，银粒子表面容易被氧化导致稳定性下降，银也具有抗微生物性，因此能在其表面上实现生物兼容的种类有限，这些问题让银溶胶在某些方面的应用受到了局限。相对来说，金溶胶或金粒子表面较稳定不易氧化，而且具有更广的生物兼容性，而这方面的研究较少。

发明内容

针对以上问题，本发明的目的是提供一种稳定的、SERS效应强的杆菌类生物标志物灵敏检测的方法。

本发明中，由非离子型高分子化合物作为粘附剂，在圆形金电极表面上组装上一定尺寸范围的金纳米粒子，而金粒子表面组装上杆菌类芽孢中特有的成分，即其生物标志物，此种成分在其他菌类中不多见，常见于杆菌类芽孢中。然后利用表面增强拉曼光谱(简称“SERS”)技术在金电极基底上对金纳米粒子/芽孢标志物的复合体进行检测，纳米金粒子-粒子之间以及粒子-电极表面之间所具有的SERS“热点”效应很强，可以对微量被测物进行灵敏检测并获得较理想的检测限。

本发明的技术方案具体介绍如下。

一种杆菌类生物标志物灵敏检测的方法，具体步骤如下：

1)将经过抛光处理的金电极在非离子型高分子化合物的乙醇溶液中浸泡，之后再用乙醇和去离子水洗涤，得到经非离子型高分子化合物修饰的金电极；

2)将经非离子型高分子化合物修饰的金电极浸泡在金纳米粒子溶胶中进行纳米粒子的自组装，得到金粒子组装的金电极复合基底；

3)将不同浓度的杆菌类生物标志物的溶液滴加到金粒子组装的金电极复合基底上，然后将其安装到拉曼光谱仪的样品台上进行检测，实现杆菌类生物标志物的灵敏检测；其中：所述杆菌类生物标志物为2,6-吡啶二羧酸。

本发明中，步骤1)中，金电极为圆形金面电极。

本发明中，步骤1)中，抛光处理时采用铝粉。

本发明中，步骤1)中，抛光区域为直径在1.5-2.5mm直径的圆形区域。

本发明中，步骤1)中，非离子型高分子化合物的乙醇溶液的质量浓度为2～10wt％。非离子型高分子化合物为聚乙烯吡咯烷酮。

本发明中，步骤2)中，金纳米粒子溶胶由HAuCl₄和柠檬酸钠反应得到；金纳米粒子溶胶中的金纳米粒子的粒径在1～100nm之间。

本发明的杆菌类生物标志物灵敏检测的方法，具有以下优点

(1)稳定性好。本发明采用在生物体系中稳定性好的金电极和金纳米粒子作为基底，克服了早期报道大部分所采用的银纳米粒子作为基底在生物体系中表面容易被氧化导致稳定性下降的问题，金表面较稳定不易氧化。

(2)兼容性强。本发明采用的金体系，避免了以前用银作为基底带来的抗微生物性，能在银表面上实现生物兼容的种类有限，相对来说，金溶胶或金粒子具有更广的生物兼容性，可以有多种方法将生物分子兼容到其表面上。

(3)表面增强SERS效应高。经过粒径优化后制备的SERS基底实现了金粒子-粒子之间以及金粒子与金电极之间存在足够多的表面增强拉曼光谱(SERS)检测的“热点”，利用金粒子之间以及金粒子和金电极之间的双重共振耦合效应，可以获得很强的SERS响应，为信号放大奠定基础。利用表面增强拉曼光谱(SERS)可以获得金纳米粒子表面上被测物分子极大增强的信号，解决了水相中被测物分子的SERS信号较弱的问题。本发明的方法用于生物标志物灵敏检测，其检出限低至0.0001ppm。