[发明专利]一种高灵敏度的OsHV‑1实时荧光定量PCR检测试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种牡蛎疱疹病毒OsHV-1的检测，具体涉及一种OsHV-1实时荧光定量PCR检测试剂盒及方法。

背景技术

牡蛎是世界重要养殖贝类，在我国和世界上很多沿海地区广泛分布。牡蛎养殖产量居海产动物首位，具有很高的经济价值。但牡蛎经常爆发大规模死亡，严重制约着牡蛎养殖业的发展，造成严重经济损失。1972年在美洲牡蛎中首先发现了牡蛎疱疹病毒OsHV-1。目前OsHV-1已被证明与牡蛎的大规模死亡有关。

为了降低牡蛎疱疹病毒OsHV-1造成的经济损失，往往需要对养殖水体及牡蛎进行检测。目前为了获得相对较高的特异性，对牡蛎疱疹病毒OsHV-1的检测方法通常采用巢氏PCR的方式。

例如，中国专利申请201510623544公开了一种牡蛎疱疹病毒I型检测引物和方法，它包括外引物PFor1、PRev1和内引物PFor2、PRev2。该方法利用巢氏PCR技术，采用两对PCR引物，通过两轮PCR反应扩增，最后对扩增产物进行电泳，根据电泳扩增条带情况判断样本是否感染牡蛎疱疹病毒OsHV-1。

再例如，中国专利申请201610052695公开了一种牡蛎疱疹病毒不同变异株的巢式PCR检测方法。该检测方法以牡蛎疱疹病毒DNA聚合酶基因功能结构域核苷酸序列为模板，设计两对嵌套式引物，并以此为主题设计巢式PCR检测方法。同样，该方法也是通过两轮PCR反应扩增，最后对扩增产物进行电泳，根据电泳扩增条带情况判断样本是否感染牡蛎疱疹病毒。

利用巢氏PCR技术对牡蛎疱疹病毒OsHV-1进行检测，虽然具有相对较高的特异性，然而上述方法都具有一个严重的缺陷，即需要通过两轮PCR扩增，也就是需要开管取产物才能进行第二轮扩增，并且都需要进行配制琼脂糖凝胶电泳。正是由于巢氏PCR具有较高特异性，因此极易受到污染产生假阳性结果，开管进行两轮PCR反应、配制琼脂糖凝胶等步骤又大大增加了待检测样品收到污染的可能性。另外，上述方法需要使用到具有严重毒性的DNA燃料，并不利于环保。因此，尽管巢氏PCR技术具有较高的特异性，然而其极易受到污染并产生假阳性结果。

也有将环介导等温扩增技术用于牡蛎疱疹病毒OsHV-1的检测方法。例如中国专利申请201610231091公开了鉴定或辅助鉴定牡蛎疱疹病毒的引物组合物，并通过环介导等温扩增技术对OsHV-1进行检测。然而环介导等温扩增技术是链置换合成，扩增的靶序列长度相对较短，通常在260bp左右，当序列长度大于400bp则较难扩增，因此其使用的范围相对较窄；更重要的是，由于环介导等温扩增的灵敏度相对较高，也因此极易受到污染而产生的假阳性结果；另外，其在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均逊色于传统的PCR方法。环介导等温技术由于其适用范围窄，极易受污染出现假阳性，即准确性和可重复性较差，后续操作不便等诸多缺陷，因此在实际使用中并不适用于OsHV-1的检测工作。

除了上述两种方法，还有使用实时荧光定量PCR技术对牡蛎疱疹病毒OsHV-1进行检测。例如中国专利申请201610236196公开了鉴定或辅助鉴定牡蛎疱疹病毒的试剂盒及其专用引物，其利用TaqMan实现对OsHV-1进行检测。该方法虽然具有相对较高的灵敏度，然而其特异性确远不如巢氏PCR技术。

综上所述，开发出一种灵敏度、准确性、特异性、可重复性均相对更高，且操作便捷的OsHV-1检测方法、试剂、或试剂盒是牡蛎养殖业中亟待解决的技术问题。

发明内容

如无特殊说明，本发明中的：

术语“RNase free H₂O”指不含RNA酶以及任何DNA的纯水或超纯水。

本发明要解决的技术问题是提供一种用于牡蛎疱疹病毒OsHV-1检测的试剂盒及方法，使其灵敏度、准确性、特异性、可重复性均相对更高，且操作便捷。

一个方面，本发明提供了一种检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的引物组。

本发明所述的一种检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1的引物组由引物OsHV-F1、引物OsHV-R1、引物OsHV-F2和引物OsHV-R2组成；

本发明所述的引物OsHV-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

5’-TGGTGGCGTTCCACAACTTGGCA-3’：

本发明所述的引物OsHV-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：

5’-GAGAGCAGACCAAATGCATCGCCA-3’：