[发明专利]一种雨生红球藻绿色细胞保藏以及虾青素诱导的规模化生产方法

说明书

本发明涉及一种适合规模化生产的雨生红球藻绿色细胞保藏以及后续虾青素诱导的方法，属于生物技术领域。本发明公开的方法，首先通过浓缩、混合、离心制备含有冻存剂和脱脂乳的雨生红球藻绿色细胞藻泥，经过4℃预冷后在‑20℃下冷冻保藏。保藏后的藻细胞通过水浴解冻、冻存剂洗脱和低氮弱光培养进行藻细胞的活化，而后利用营养缺失和添加混合碳源的方式，实现绿色细胞的快速诱导和虾青素的积累。本发明操作简单，适合大规模生产应用，可以有效地解决生产企业冬季停产的困境，实现冬季生产的绿色藻细胞在春季进行虾青素诱导，提高设备和人员的生产效率以及虾青素的产量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别提供了一种适合规模化生产的雨生红球藻绿色细胞保藏以及后续虾青素诱导的方法。

背景技术

在雨生红球藻的大规模养殖中，通常采用两步法进行培养：第一步为绿色扩培，在环境适宜、营养丰富的条件下雨生红球藻以绿色的营养细胞形态存在，在这个过程中藻细胞分裂繁殖，产生大量带鞭毛的游动细胞，此时细胞脆弱，对光、温度等环境因素敏感，因此，绿色扩培通常在温度与光照控制良好的室内进行。第二步为虾青素诱导，将绿色细胞置于不利的环境条件，细胞失去鞭毛，以不动的厚壁孢子形态存在，这时细胞内会积累大量的虾青素以对抗不利的环境条件，由于需要高光照的刺激，因此，虾青素诱导通常在室外进行。在实际的生产过程中，尤其是在北方地区，冬季室外温度低，无法进行虾青素的诱导培养，养殖企业不得不面对冬季停产的困境，造成设施和人员的闲置和浪费。而绿色扩培阶段是在室内进行，不受气候条件的影响。因此，如果能够将冬季室内生产的绿色细胞进行保藏，待春季气温回升之后再进行虾青素诱导，可以实现全年的生产，提高虾青素的产量。

藻种保藏常用的方法主要是低温（4℃）、冷冻（-20）、超低温保藏（-60~-196℃）等，其中超低温保藏法仅适用于少量藻种的保藏，低温保藏法中藻细胞存在一定的生理活动，随时间延长，藻细胞逐渐降解，同时由于细菌在低温条件下仍然会繁殖，长时间保藏也会腐败变质。冷冻保藏法能够保藏较长时间，同时工艺相对简单，具备规模化藻细胞保藏的潜力。

由于不同藻种对冷冻条件的耐受性不同，这也导致了不同微藻冷冻保藏时的方法和结果有很大差别。文章《3种优质海洋微藻的低温保存研究》报道了在-20℃条件下保存亚心型扁藻、三角褐指藻、球等鞭金藻的方法，但仅扁藻在10%DMSO+10%蔗糖条件下的存活率达到60.2%，但解冻后的生长速率仅为0.12 d^-1，其他两种藻的存活率极低。文章“海链藻絮凝和凝后保存技术研究”报道了使用10%甘油在-20℃条件下保存壳聚糖絮凝的海链藻，在保藏后比生长速率稍有降低，但是由于甘油粘稠，不易除去，后续培养中易造成污染。专利201010222005.0公开了一种保藏小球藻、葡萄藻、小环藻、微绿球藻、硅藻藻种的方法，采用-60℃低温预冻后冷冻真空干燥的工艺，但该方法生产成本高，只适合小量的菌种保藏，不适合规模化应用。

雨生红球藻绿色扩培的细胞脆弱，在冷冻保藏过程中鞭毛易受到冰晶和冷冻剂的损伤和毒害，同时后续的虾青素诱导需要高光、高盐、营养缺失等条件的刺激，因此，冷冻保藏细胞活性的保持以及后续的诱导方法是需要解决的关键问题。另外，规模化绿色扩培细胞密度通常不高，培养体积大，因此将细胞浓缩为藻泥的状态可以减小保藏体积，降低生产成本。但目前尚未有关于雨生红球藻藻泥大规模保藏以及后续虾青素诱导方法的相关报道。而现有的微藻保藏方法存在成本高、存活度低、局限于部分藻种、不适合规模化生产等缺点，无法应用于雨生红球藻的生产过程中。

因此，需要开发雨生红球藻规模化生产过程中绿色细胞冷冻保藏以及后续保藏细胞的复苏与虾青素诱导工艺。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种适合规模化生产的雨生红球藻绿色细胞保藏以及后续虾青素诱导的方法，采用的技术方案如下：