[发明专利]一种羊无浆体病间接ELISA诊断试剂盒及其制备方法

说明书

本发明涉及一种检测羊无浆体（Anaplasmaovis）血清抗体的以重组表达的P35为抗原的间接ELISA诊断试剂盒、P35重组抗原及其制备方法。该试剂盒仅与A.ovis阳性血清发生特异性反应，具有良好的特异性；该试剂盒具有良好的敏感性，可检测到羊无浆体早期感染产生的抗体，并能从1：800稀释的阳性血清中检测到抗体。试剂盒重复性良好，操作相对简便，可应用于羊无浆体病流行病学调查和免疫抗体水平检测。

技术领域

本发明涉及免疫学检测领域，具体为一种羊无浆体病间接ELISA诊断试剂盒及其制备方法。

背景技术

无浆体是一类由蜱传播的专性胞内寄生菌，主要寄生于牛羊等反刍动物红细胞内，导致无浆体病，旧称边虫病。无浆体与人埃立克体均归类为变形菌纲、立克次氏体目（Rickettsiaies），无浆体科（Anaplasmatacea），无浆体属（Anaplasma），其中羊无浆体（A. ovis）是重要的组成成员，可以引发小反刍动物的无浆体病。该病临床症状为发热、贫血、黄疸、衰弱和渐进性消瘦。血象检测表现为红细胞数量、红细胞压积和血红蛋白含量显著下降，严重感染时可以导致死亡。该病在世界各地广泛流行，在我国许多地区也时有发生，严重阻碍了畜牧业的发展，给畜牧业造成了巨大的经济损失。因此，建立快速、灵敏、准确又操作方便的检测方法十分必要。

国内外学者对羊无浆体的检测方法进行了一系列的研究工作，血涂片镜检法、补体结合试验（CF）、卡片凝集试验（CAT）、间接荧光抗体试验（IFAT）、PCR方法等，血涂片镜检法是实际中应用最多的方法。然而该方法需要较强的专业知识来与泰勒虫、巴贝斯虫等血液寄生虫感染进行区别，而且该方法不利于感染早期和感染持续期染虫率极低的情况。虽然补体结合试验（CF）、卡片凝集试验（CAT）、间接荧光抗体试验（IFAT）等也有应用的报道，但补体结合试验操作复杂，不易推广；卡片凝集试验操作简单，但敏感性较差，这些血清学方法鲜有在实践中大量使用的报道，这些方法尚需进一步评价其检测性能。PCR方法虽是一种比较快速灵敏的分子诊断方法，但其需要琼脂糖凝胶电泳分析结果，所需试剂如溴化乙锭，操作稍不慎就对使用者和周围环境产生毒害，而且PCR仪器和凝胶成像系统昂贵，难以在基层单位中推广。至今，世界尚没有用于羊无浆体感染检测的商品化的血清学试剂盒。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足，仅与A. ovis抗体发生反应，而不与其他蜱传病原或相关细菌的抗体发生交叉反应，用于检测A. ovis血清抗体的间接ELISA试剂盒，同时提供制备这一检测试剂盒的方法和试剂盒中所用的A. ovisP35重组抗原，以及这种重组抗原的制备方法。

本发明的羊无浆体间接ELISA抗体检测试剂盒中包括；已包被抗原、真空包装的酶标板（2块）；标准阳性血清1支（100μl）；标准阴性血清1支（100μl）；50倍HRP标记的兔抗羊抗体1支（100μl）；血清稀释液1瓶（20ml）酶标抗体稀释液1瓶（20ml）；TMB显色液1瓶（20ml）；终止液1瓶（20ml）；50倍浓缩洗涤液1瓶（20ml）。试剂盒4℃保存，保存期为6个月。试剂盒可检测180份血清。

本发明的羊无浆体间接ELISA抗体检测试剂盒中宝贝酶标板的抗原为重组蛋白，为大肠杆菌表达蛋白，表达的基因位于P35基因的73bp-969 bp，经测序，其序列为SEQ IDNo.1，长度为897 bp，包含P35特异性的抗原表位。